脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的原因分析

摘要：脱氧雪腐镰刀菌烯醇是最常见的天然真菌毒素之一，感染脱氧雪腐镰刀菌烯醇病毒后将对人和家畜造成了很大的安全危机，且造成严重的经济损失。为了有效防控这一危机，必须从根源上查找脱氧雪腐镰刀菌烯醇病毒感染的原因。故本文探究分析了脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的原因，文章先介绍了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的基本信息，又通过一系列实验步骤得出脱氧雪腐镰刀菌烯醇在不同试验条件下的含量值（通过超高效液相色谱法测得）。最后总结出脱氧雪腐镰刀菌烯醇在环境湿度较高，温度较适宜，储存时间越长的条件下越容易产生。为以后谷物对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的防治提供了科学的依据。

关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇；温度；水活度；储存时间

脱氧雪腐镰刀菌烯醇主要由禾谷镰刀菌（F. graminearum）和黄色镰刀菌（F. culmorum）等产生，在小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物中含量较高。谷物脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染在全球范围内易多发，主要原因是谷物在田间受到禾谷镰刀菌等真菌侵染，导致小麦发生赤霉病和玉米穗腐病，在适宜的气温和湿度等条件下繁殖并产脱氧雪腐镰刀菌烯醇。我国麦类及其他谷物赤霉病的流行主要分布于长江以南区域，每隔3年至5年一般有一次比较大的流行，在长江、淮河、黄河流域呈多发态势。

谷物及谷物产品是国民经济中重要的一部分[1]，谷物及谷物产品质量的好坏与人民的生活息息相关。脱氧雪腐镰刀菌烯醇即DON被认为是谷物及其产品中最常见的天然真菌毒素之一，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的肆虐严重影响了全球经济发展及人、畜的生命健康[2]。故为了经济的发展以及人民、各类家畜的安全，我们必须对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行研究，分析其产生的原因。

1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的介绍

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（见图1）是单端孢菌烯基团的一部分[3]，该家族是200多种霉菌毒素的大家族，含有三环12，13-环氧单端孢霉-9-烯核结构[4]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇主要由禾谷镰刀菌（Fusarium.graminearum）和黄色镰刀菌（F.culmorum）浸染小麦、大麦、油菜籽等粮食作物产生，谷物脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染在全球范围内易多发，主要原因是谷物在田间受到禾谷镰刀菌等真菌侵染，在适宜的气温和湿度等条件下繁殖并产脱氧雪腐镰刀菌烯醇[5] [6]。我国麦类及其他谷物被禾谷镰刀菌浸染流行主要分布于长江以南区域，每隔3年至5年一般有一次比较大的流行，在长江、淮河、黄河流域呈多发态势。呕吐毒素是玉米和小谷物中发现的主要毛孢菌毒素之一，它对经济产生重大影响。镰刀菌毒素在全球范围内造成了巨大的经济损失。在镰刀菌爆发的几年里，可造成经济损失约4600万美元[7]。众所周知，谷物收获前和储存期间可能会发生霉菌生长和潜在的DON产生，这是由于田间阴冷潮湿的环境，或者由于贸易过程中谷物干燥不足导致水分含量高而引起的。除呕吐毒素污染外，镰刀菌疫病也是最严重的植物病害之一[8]，它导致品质下降并降低了谷物产量。而且由于DON具有很高的稳定性，因此它在谷物加工过程中很难消除，并且在某些情况下，其浓度还可以增加。

据报道，由于急性或长期的脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露，造成了许多有害影响。高剂量摄入会引起头痛，喉咙刺激，腹泻，恶心，呕吐和胃肠道出血。在短时间内过度暴露可导致严重后果，如死亡[9]。动物中长期服用脱氧雪腐镰刀菌烯醇会导致营养失调，例如体重减轻和厌食以及免疫问题，具体取决于剂量和暴露比。国际癌症研究机构（IARC）对人类致癌性的评估将DON归入第3组（无法分类为对人类致癌性）。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇在产生过程中受温度、湿度及储存时间的影响，此影响因素还需进一步探究。选用小麦样品为培养材料， 禾谷镰刀菌为所接种菌株，首先进行辐照灭菌处理，之后接种所选菌株， 在几个不同的温度、水活度条件下分别培养不同的时间。然后使用超高效液相色谱仪分别计算每一个培养基的生成量。以此找出脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的最适条件，为以后的农业生产提供科学性的数据支持来防止真菌毒素的污染。

2、试验所选材料与方法

2.1材料与试剂

甲醇、乙腈，均为色谱纯，选用美国Fisher公司；乙酸铵；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品（纯度≥99%），选用以色列FERMENTEK公司；乙腈-水（流动相）：量取10 mL乙腈添加90 mL水；除另有规定外，所用试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求；选用美国的禾谷镰刀菌菌株；小麦籽粒选用河北省超市的。玻璃注射器，10 mL 或20 mL；玻璃纤维滤纸，Φ9cm； 滤 膜，0.22μｍ孔径有机相滤膜，或相当者。

2.2主要仪器

本试验使用岛津超高效液相色谱仪LC－30A二元高压梯度系统，具体配置为：LC－30AD 输液泵，DGU－20A5在线脱气机，SIL－30AC自动进样器，CTO－30A柱 温 箱，SPD－20A紫外检测器；青岛海博的PDA、PDB培养基；上海一恒的霉菌培养箱；维也纳的型号为4K 10的Sigma离心机；德国的MM 2000机械研钵。

2.3试验方案步骤

2.3.1小麦籽粒辐照灭菌

首先称取10公斤河北省一超市中的小麦籽粒，平均分成10个包装，每个包装1公斤重，且将这十个包装袋分别置于密封袋中，确保不受其他细菌微生物的污染。将这些小麦样品置于电子束下进行辐照灭菌，灭菌后将这些样品放置于4 ℃的环境中。

2.3.2 培养菌株

灭菌后进行接种步骤，用于接种的菌株为产自美国的禾谷镰刀菌菌株 ，第一次使用的培养基为PDA培养基，第一次接种后要将培养基放置于温度为：28℃的黑暗环境中，放置时间为：一周。之后进行第二次接种，第二次接种所选的培养基为PDB培养基，第二次接种后首先进行震荡，震荡转速为150r/min，震荡后将培养基放置于温度为：25 ℃的环境中，放置时间为5天。5天之后收取用于后续接种的孢子液，所需孢子液的浓度为105个/mL。若达不到此浓度要求，可使用无菌水进行调整处理。

2.3.3 给小麦籽粒进行接种

要在严格无菌的条件下进行此操作，以防给样品带来其他细菌污染。首先试验人员戴上无菌橡胶手套，在经过酒精消毒的称量台上称取小麦样品。此处要准备若干个刻度为250 mL的无菌锥形瓶，用来放置称取的小麦样品。所需称取的小麦样品质量为50 g，要将样品置于上述准备的无菌瓶中。此后用无菌水配置成一定浓度，接种上述2.3.2得到的孢子液，所需孢子液为：100μL。接种之后摇匀培养液并且密封保存。此试验设置的水活度数值为：0.95 aw、0.98 aw，培养温度为：10 ℃、20 ℃、30 ℃，培养时间为：一周、两周、三周、四周、五周，培养环境为：黑暗。将小麦样品分别于每个对应条件下进行培养，每个相同条件做3次试验，以防误差出现。最初培养的一周内，要保证菌株与样品完全接触。

2.3.4 对培养物进行处理

上述培养条件均完成后，进行此步骤处理。首先将样品进行干燥，所需温度为50℃。干燥之后使用德国的MM 2000机械研钵进行粉碎，称取2 g样品于锥形瓶中，加入10 mL流动相，高速匀浆2 min。玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清。将免疫亲和柱连接于注射器下，准确移取2 mL滤液至注射器中，以每秒１滴的流速过柱，至空气进入柱中。用5 mL水以每秒１滴的流速淋洗免疫亲和柱，使约2～3 mL空气进入柱中。准确加入1 mL的甲醇，以每秒1滴的流速洗脱，洗脱液氮吹至干，用0.5 mL流动相旋涡溶解，经0.22 μm 针式滤器过滤后进样。

2.3.5液相色谱条件

色谱柱：100 mm× 3.0 mm， 2.7 mm；流动相：乙腈/水（10/90，v/v）；流速：0.4 mL/min；进样体积：3μＬ；柱温：40 ℃。

2.3.6方法学验证

首先制作一个标准工作液，制作方法为：取一些脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，然后用一定量的乙腈稀释此标准品，所需标准液浓度为：1 mg/mL。设置一个空白样品，仿照上述2.3.4制成一个空白溶液。将两个溶液配置成一定梯度浓度的溶液（1、2、5、10、20、50、100、 200 μg/L ），通过一系列步骤来计算回收率以及精密度。除此之外还要计算线性、定量限以及检出限等。

3 所得实验结果

3.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量测定的方法学验证

经过上述试验及计算，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的各项指标及数据分别见表1、表2所示，得到的图谱见图2、图3。

结果表明：脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率：83.57—99.21%，精密度：6.5—10.8%。

由以上两个表的数据可知，此方法的分析效果良好。

3.2 不同培养条件下小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生情况

小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇在各个条件下产生的情况见下列图4、图5。

由图4、图5数据可知，培养时间越长，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产量越高；水活度为0.98 aw，温度为20 ℃，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产量最多；水活度为0.95 aw，温度为10 ℃，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产量最少。

4.根据试验结果分析DON产生原因

为了研究分析脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的原因，本试验通过对10 公斤的小麦籽粒进行研究DON产生的原因。首先对10公斤小麦籽粒进行灭菌消毒 ，通过前期前人的研究知禾谷镰刀菌是脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的主要原因菌株。故本试验接种此重要原因菌株，然后给其设置一系列环境条件来探究其最适合生存的生活环境。本试验设置的条件有：（1）不同的水活度：0.95 aw、0.98aw；（2）不同的培养温度：10 ℃、20 ℃、30 ℃；（3）不同的培养时间：一周—七周。由上述试验3.1所做方法学验证结果知，选用超高效液相色谱法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，试验结果准确，灵敏，故所选方法即超高效液相色谱法适用于氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测。由上述试验3.2在不同培养条件下使用超高效液相色谱法测得的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量结果知：（1）对于培养时间来说，脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的量与培养时间成正比，培养时间越长，产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇量越多；（2）在培养温度为20 ℃，培养水活度为 0.98 aw条件下，产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇量越多。故由试验可得出谷物产品在侵染禾谷镰刀菌株条件下，生活的环境湿度较高（水活度为0.98 aw），温度较适宜（20 ℃ ），储存时间越长越容易感染脱氧雪腐镰刀菌烯醇病毒。

结语

综上所述，由试验可得出谷物产品在侵染禾谷镰刀菌株条件下，生活的环境湿度较高（水活度为0.98 aw），温度较适宜（20 ℃ ），储存时间越长越容易感染脱氧雪腐镰刀菌烯醇病毒。脱氧雪腐镰刀菌烯醇病毒对人和家畜造成了很大的安全危机，且可造成严重的经济损失。所以在谷物储存过程中，要使用高效通风设备和低温处理技术，保持较为有利的低温和干燥储存环境；在运输过程中要尽可能地缩短运输时间；定期检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量，严格控制谷物的新陈代谢过程，以减缓毒素的扩散。

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