肺泡灌洗液三种检测方法对肺非结核分枝杆菌病诊断效能的研究

非结核分枝杆菌（NTM）肺病近年呈增长趋势，但与结核杆菌感染症状相似，诊断困难[1]。传统罗氏培养法耗时长，PCR-反向点杂交技术检测范围有限，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术应用于分枝杆菌鉴定研究尚少，比较三者诊断效能对临床诊疗意义重大。

一、研究资料与方法

（一）一般资料

选取2021 年1 月至2025 年1 月在我院就诊的50 例有结构性肺部疾病患者，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、支气管扩张症、囊性纤维化、尘肺病、肺结核病等患者。其中男性 28 例，占比 56% ，女性 22 例，占比 44% ；年龄范围为25-75 岁，平均年龄（ 52.3±10.5 ）岁。所有患者均符合相关疾病诊断标准，且自愿参与本研究并签署知情同意书。采用随机分组方式，将患者平均分为两组，每组 25 例，两组患者在性别、年龄、疾病类型等一般资料方面经统计学分析，P 值均大于0.05，差异无统计学意义，具有可比性。

（二）实验方法

1.标本采集、保存与运输：患者行支气管镜检查时，常规进行术前准备和麻醉，依据胸部CT 定位，选择病变所在的相应支气管肺段行支气管镜肺泡灌洗。在选定的肺段或亚段开口处，注入 37^∘C 无菌生理盐水 30ml ，每次注入后立即负压吸引，重复2 次，确保回吸收灌洗液 15ml 以上。采集后的标本室温放置不超过 24h， 2-8^∘C 保存不超过 1 周， -20^∘C 冰箱保存不超过 3 个月，采用加冰的泡沫箱密封运输至实验室。

2.罗氏培养法：取液化和离心处理后的肺泡灌洗液 400μl ，接种于酸性改良罗氏培养基斜面，保证覆盖整个斜面，每份标本接种两管培养基，于 37^∘C 培养。每周观察一次生长情况，若出现可见典型菌落，进行抗酸染色鉴定是否为分枝杆菌菌落，培养8 周未见菌落则判定为阴性。对酸性罗氏培养基上生长的菌落，在吐温生理盐水中磨成菌液，分别接种到含对硝基苯甲酸（PNB）和含噻吩-2-羧酸肼（TCH）的中性罗氏培养基，同时接种一管未加药的中性罗氏培养基作为对照， 37^∘C 培养 4 周后观察生长情况，依据对照管生长情况及 PNB、TCH 培养基生长情况初步鉴定分枝杆菌类型。

3.PCR-反向点杂交技术：肺泡灌洗液沉渣经 4%NaOH 液化、离心后，依次用 M 洗液洗涤、M 裂解液处理，沸水浴后离心留取上清液作为 DNA 模板。进行 PCR 扩增时，向 PCR 反应管加入模板 DNA，并设置阳性质控品和阴性质控品。扩增产物与膜条在 AT 液中混合，沸水浴加热后，于分子杂交箱 59^∘C 杂交1.5h 。杂交后依次进行洗膜、显色操作，通过观察膜条显色情况判断结果。

4. 基 质 辅 助 激 光 解 析 电 离 飞 行 时 间 质 谱 技 术 ： 肺 泡 灌 洗 液 经N-acetyl-L-cysteine-NaOH 处理后，用乙醇灭活细菌，防止生物污染，运输至实验室。按照试剂盒说明书提取标本DNA，进行PCR 扩增、SAP 反应、延伸反应、样本脱盐等操作，最后将处理后的样本点样到芯片上，分析质谱结果。

（三）观察指标

1.分别统计罗氏培养法、PCR-反向点杂交技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术检测非结核分枝杆菌的检出率[2]。

2.比较三种检测方法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致性。

（四）研究计数统计

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料以 表示，采用t 检验；计数资料用 n(%) 表示，采用χ ²检验。 P<0.05 表示差异具有统计学意义。

二、结果

（一）三种检测方法的检出率

（二）三种检测方法的诊断效能指标比较

由表2 可见，在灵敏度、特异度等各项诊断效能指标上，三种检测方法差异显著（ P<0.05) 。

三、讨论

本研究结果表明，罗氏培养法、PCR-反向点杂交技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在肺非结核分枝杆菌病诊断中各具特点。罗氏培养法作为传统检测方法，虽具有一定的诊断价值，但由于培养周期长达8 周甚至更久，容易错过最佳治疗时机，且部分菌株可能因培养条件苛刻、营养需求特殊等因素无法生长，导致检出率较低，仅为 20% ，灵敏度也只有 40‰ 。PCR-反向点杂交技术检测速度相对较快，能鉴定出部分常见分枝杆菌，但检测范围有限，对于检测范围外的菌种无法识别，限制了其在临床的广泛应用，其检出率为 32% ，灵敏度为 64‰ 。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术凭借其快速、准确的特点，在多项诊断效能指标上优于前两种方法，检出率达到 44% ，灵敏度、特异度等关键指标均表现优异，能够对多种微生物进行鉴定，为临床诊断提供更全面的信息[3]。在实际临床应用中，单一检测方法难以满足准确诊断的需求，联合使用多种检测方法，如先用 PCR-反向点杂交技术进行快速初筛，再用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术进行精准鉴定，可充分发挥各自优势，提高肺非结核分枝杆菌病的诊断准确性，为患者制定更合理的治疗方案。

四、结论

三种方法诊断效能有差异，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术表现更优，可作重要诊断手段。未来需扩大样本、多中心研究，优化联合检测方案。

参考文献

[1]陈华,陈品儒.《T/CHATA-001-2025 非结核分枝杆菌病诊断》团体标准2025年更新版解读[J].结核与肺部疾病杂志,2025,6(02):135-142.

[2]梁建琴,吴雪琼,安慧茹.核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识[J].中国防痨杂志,2023,45(06):543-558.

[3]黄春琴.次要分枝杆菌引起的非结核分枝杆菌病 2 例报道并文献复习[D].广西医科大学,2021.

基金：江西省卫生健康委科技计划项目（编号：202130963）