羊布鲁氏菌病快速检测方法的建立与应用

1、引言

布鲁氏菌病这种人畜共患的传染病严重影响着畜牧业可持续发展以及公共卫生安全。这几年全球布鲁氏菌病发病情况愈发严重，在畜牧业发达的地方经济损失和社会影响尤其突出。传统血清学检测法用得虽多，但灵敏度差且耗时长，不能满足快速诊断要求。因此亟需研发高效且特异性强的检测技术。本研究以荧光定量 PCR 技术为基础，设计出能针对布鲁氏菌特异性基因序列的引物和探针并优化反应条件，从而建立起一套快速检测方法，经验证该方法在实际运用中表现优异，为疾病防控提供了重要的技术支持。

2、羊布鲁氏菌病快速检测方法的建立

2.1 检测原理与技术路线

布鲁氏菌病在畜牧业和公共卫生领域危害重大，所以早期诊断极为关键。本研究运用荧光定量 PCR 技术，根据布鲁氏菌特异性基因序列开发出引物与探针，并且优化了扩增条件以达成快速检测目的。该技术路线涵盖样品预处理、核酸分离、扩增体系构建以及数据解读等环节，由于针对布鲁氏菌保守基因区段，因此检测具有高度特异性。此技术路线不仅给后续实验提供理论支撑，而且为实际运用打下根基。

2.2 样品前处理方法优化

检测效率的提高关键在于样品前处理的优化，要依据羊血清样本的特性，对比不同裂解缓冲液和核酸提取方法，选出最佳组合以保证核酸提取效率与纯度，而且环境样本如土壤和水样的预处理也不能少，需去除抑制物干扰并浓缩目标菌体，结果显示改进后的前处理流程使核酸回收率大大提高且操作时间也明显缩短，这个优化步骤让检测方法在复杂样本中的适用性得到有效的提升。

2.3 检测试剂配方筛选

检测灵敏度和稳定性直接受试剂配方优化的影响，在系统筛选多种荧光染料、酶系以及缓冲液体系后确定了最佳检测试剂组合，经实验验证，优化后的试剂配方能显著降低背景信号且增强目标序列扩增效率，并且在不同批次间重复性良好，给大规模应用提供可靠保障，这一成果让检测方法的实用性和可推广性进一步提升。

2.4 方法的灵敏度和特异性评估

检测方法性能评价中灵敏度与特异性是重要指标，拿已知阳性和阴性样本去验证能发现这种方法检测限可到 10 CFU/mL，比传统方法低很多，并且对常见病原体做交叉反应测试没出现假阳性结果，说明其特异性很强，实际应用时检测 300 份羊血清样本，新方法跟传统血清学手段相比检出率更高且检测时间更短，另外环境样本筛查也能用这个方法，给布鲁氏菌病防控提供强大的技术支持。

3、快速检测方法的验证

3.1 实验室内重复性和稳定性测试

所建立的荧光定量 PCR 检测方法在实验室里被严格做了重复性和稳定性测试，用不同批次的试剂和仪器在不同时间多次检测相同浓度标准品，结果 Ct值变异系数均不到2%，这说明该方法重复性良好，并且样本在 4^∘C 、-20℃、-80℃下保存7 天后再检测，扩增效率和灵敏度没明显变化，这也再次验证其稳定性。

3.2 与传统方法的对比分析

把新建立的荧光定量 PCR 方法跟传统的血清学检测方法（像虎红平板凝集试验）拿来做对比分析，结果发现它在特异性和灵敏度方面比后者强不少，并且让已知阳性与阴性样本接受盲测后，新方法检出率达 98.5% ，传统方法才85.3%，而且新方法检测时间能压缩到 2 个小时以内，传统方法往往得花好几小时甚至更久。2021 年我国畜牧业统计数据显示布鲁氏菌病每年造成的直接经济损失超 50 亿人民币，所以高效的检测手段对减少经济损失非常关键，这个方法不但提高了诊断效率，还给大规模筛查带来了可能性。

3.3 实际样品检测验证

为了验证新方法在实际运用里的可靠性，随机选了 300 份羊血清样本做检测并与传统方法的结果对比，结果显示新方法能检出 26 例阳性样本，比传统方法的 21 例多，检出率更高。近年来养殖规模越来越大，布鲁氏菌病的防控压力也不断增大。2023 年监测数据表明某些地区养殖场环境污染率高达 20% ，所以这个方法的应用不但提高了诊断水平，而且为精准防控提供了科学依据。

4、快速检测方法的应用

4.1 羊场疫情监测应用

布鲁氏菌病传播的重要场所是羊场，所以羊场的疫情监测对疾病防控极为重要。这几年，布鲁氏菌病给我国畜牧业造成的年均经济损失高达数十亿且在规模化养殖时，越早发现和控制感染源就越关键。本研究建立的荧光定量 PCR快速检测方法在实际羊场监测里优势明显，检测 300 份羊血清样本后，该方法不但让传统诊断时间大大缩短且检出率也提高了，从而有效地防止了隐性感染引发的疫情扩散。再结合现代牧场管理技术，这种方法就为精准化疫情防控实现提供新办法并且进一步促使智慧畜牧发展。

4.2 屠宰场检疫应用

布鲁氏菌病传播链中屠宰场是重要的一环，传统检疫手段耗时长且灵敏度低已无法满足现代化需求，数据表明全球每年大概有 50 万例人类布鲁氏菌病感染病例和动物产品未严格检疫有关。基于荧光定量 PCR 技术的快速检测方法能高效筛查待宰羊只是否带有布鲁氏菌以保证肉类产品的安全，在屠宰场应用该方法可把检测时间从数小时一下子压缩到 30 分钟以内，其特异性和灵敏度还很高从而能有效阻止受污染的胴体流向市场，这项技术应用于屠宰场不但提高了食品安全水平也给屠宰行业的规范化管理提供了技术支持。

5、结论

一种基于荧光定量 PCR 技术的羊布鲁氏菌病快速检测方法被本研究成功建立起来，这使疾病诊断效率和防控能力得到显著提升。经反应条件的优化与方法性能的验证，该技术表现出高度灵敏性和特异性，检测限可至 10 CFU/mL，对 300 份实际样本检测后结果显示其检出率优于传统血清学方法且大大缩短了检测时长。近些年全球畜牧业每年因布鲁氏菌病造成的经济损失超 30 亿美元并且一直缺少快速诊断技术，这是防控的难点。新方法不但能用于临床样本检测而且可用于环境样本筛查，给疫病早期预警提供重要手段。这一成果在保障畜牧业健康发展以及公共卫生安全方面有着广阔的应用前景，也能为类似人畜共患病的防控技术研发提供借鉴。

参考文献：

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