5种致病性沙门氏菌PCR鉴定体系的建立

作者简介：张趁华，（1984-），女，汉族，籍贯：河北石家庄，学历：博士，职称：讲师，研究方向：生物医学工程，

资助项目：福建省自然科学基金项目（2020J05212）；莆田学院教改项目（JG202391）。

摘要：大多数沙门氏菌存在于肉类、水产类等食品中，严重危害家畜和人类的健康，而且有多种血清型。建立5种沙门氏菌的PCR鉴定体系，可以将甲型副沙门氏菌、乙型副沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠沙门氏菌区分开来，具有一定的市场应用价值。

关键词：PCR；鉴定；沙门氏菌；

沙门氏菌存在于肉类、水产类等食品中，造成食品污染[1，2]，严重的造成食物中毒，导致免疫损伤，严重危害人体健康[3-5]，与人类的疾病密切相关。目前沙门氏菌鉴定的方法常用血清学检测[6，7]，但沙门氏菌血清学有2500多种，且血清学检测操作繁琐，检测时间长。

甲型副沙门氏菌、乙型副沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠沙门氏菌为常见的沙门氏菌，能引起人类传染病或食物中毒[8]，建立一种快速鉴定区分这5种沙门氏菌的方法，可以更好地治疗与防治。

1、材料与方法

1.1 菌种

甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、大肠杆菌均从中国微生物菌种保藏中心获得。

1.2 基因组提取

甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、大肠杆菌扩培后，利用细菌基因组提取试剂盒进行6个菌株基因组DNA的提取。

1.3 基因组DNA鉴定

用NanoDrop 2000分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）测定提取的DNA的浓度和纯度，在-20℃下储存直至使用。

1.4 序列分析

对比分析甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏杆菌的基因，筛选出flic基因，可用以设计物种特异性引物。

1.5 引物设计

虑及引物对可用于多重PCR，同时兼顾flic基因特异性和产物大小情况，设计引物。

1.6 引物特异性检测

以6个标准菌株的基因组DNA为模板，利用上述设计的特异性引物进行扩增。PCR所用酶为Easy Flash PCR MasterMix （PR0202007， Easy-Do Biotech， China），PCR体系如下： 10 μl 2×Easy Flash PCR MasterMix，0.8 μl 上游引物（10 μM），0.8 μl 下游引物（10 μM），<0.2 μg DNA 模板，加ddH2O至20 μl。预变性，98℃，30 sec；变性，94℃，10 sec，退火，60℃，15 sec，延伸，72℃，90 sec，30个循环；终延伸，72℃，1 min。

2 结果

2.1 基因组DNA提取鉴定结果

利用细菌基因组提取试剂盒提取的基因组DNA的浓度为100ng/μl左右，浓度适中；OD260/OD280指标为1.81-1.86，说明无明显蛋白质和RNA污染，DNA质量较好；OD260/OD230指标均大于2.0，说明盐残留少（表1）。

2.2引物序列

5个菌株flic基因的5端和3端序列的同源性较高，而中间序列的差异大，设计物种特异性引物如表2所示。

2.3引物特异性检测结果

利用上述设计的特异性引物进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果（图1-图5，泳道1-6分别为鼠沙门氏菌、乙型副沙门氏菌、甲型副沙门菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌为模板的扩增结果；M为DNA marker）显示，菌种特异性引物均只能扩增靶菌株的flic基因，说明引物特异性良好，可用于5种沙门氏菌的多重PCR鉴定。

3、讨论

在过去的研究中，沙门氏菌常用血清学进行检测鉴定，该方法耗时长，检测步骤繁琐，且沙门氏菌拥有多种血清学。甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏是常见的污染食品、引起食物中毒、危害人类健康的沙门氏菌，对这5种沙门氏菌建立多重PCR鉴定体系，可以快速、准确的鉴定区分这5种沙门氏菌，从而制定相应的应对方案和措施。

参考文献：

[1] 杨菁，罗荣爱，马妮，等. 云南省熟肉制品中沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌污染状况调查[J]. 中国国境卫生检疫杂志， 2024，47（5）：463-467+480.

[2] 宋晟， 郭焜鹏， 张海韵， 等. 生鲜畜禽肉中沙门氏菌污染情况调查[J]. 食品安全导刊， 2020， （15） ：2.

[3] 李静，徐贵永，张静.一起由肠炎沙门氏菌引起的食源性疾病的调查[J].健康教育与健康促进， 2020， 15（3）：2.

[4] 李代波，黄建军，郭德镔，等.一起由沙门氏菌合并副溶血弧菌引起食物中毒的调查[J].实用预防医学， 2023， 30（2）：202-205.

[5]宋秋坤，赵雯婧，王轶，等.一起农村宴席引起的肠炎沙门氏菌食物中毒事件分析[J].现代疾病预防控制， 2021（3）：252-255.

[6] 吴静芸，王于慧，郭义妹.比较分析血清学鉴定与全面生化反应在沙门氏菌检验中的应用[J]. 基层医学杂志， 2024，28（26）：67-69.

[7]杨敬金.一起由肠炎沙门氏菌引起食物中毒事件的实验室检测分析[J].继续医学教育， 2020， 34（2）：2.

[8]余树坤，刘浪，谭雅心，等.1起ST19型鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒调查，溯源分析与探讨[J].中国人兽共患病学报， 2024， 40（1）：82-89.