甘草黄酮提取物抑制胶质瘤生长的研究

摘要：目的：本研究旨在通过体外培养大鼠胶质瘤C6细胞，探讨甘草黄酮提取物对胶质瘤C6细胞凋亡的机制。方法：实验分组为空白对照组（C6细胞正常培养）和20mM、40mM、80mM给药组。通过CCK8法检测胶质瘤细胞活性并计算IC50；通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果：随着给药时间增加，与Control组相比，40mM给药组细胞形态发生改变且活性显著降低（p＜0.05）；80mM组细胞活性显著降低（p＜0.0001）；在不同浓度甘草黄酮提取物作用48h后，与Control组相比，40mM组细胞迁移率显著降低（p＜0.01）。结论：甘草黄酮提取物对C6细胞增殖有抑制作用。

关键词：胶质瘤，三羟基异黄酮，细胞凋亡

胶质瘤是大脑中最常见的原发性肿瘤。通常手术切除是胶质瘤治疗的第一步，但由于胶质瘤会侵袭正常脑组织，使得手术无法完全切除干净。并且几种常用的化疗药物的有效率均在30%以下，且本身具有毒性作用[1，2]。因此，开发新的治疗药物成为研究胶质瘤的热点与难点。甘草，是一种补益中草药，在                 吉林白城等地均有分布。甘草具有抗癌、抗炎、抗微生物等活性。黄酮类化合物和三萜皂苷类化合物被认为是甘草的生物活性化合物。目前研究显示，甘草黄酮具有抗癌和抗肿瘤的作用，而肿瘤的发生和转移与肿瘤的血管生成密不可分。近年来国内外研究表明，甘草黄酮提取物对肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多种癌症和肿瘤具有抑制效应[3]，且具有低毒性、副作用小的特点，可能成为一种很有潜力的抗肿瘤药物。有研究表明，甘草黄酮提取物诱导MCF-7细胞凋亡，其促凋亡机制可能是通过调节Bcl-2和Bax基因表达。作为抗凋亡的Bcl-2蛋白和促凋亡的Bax蛋白，在调节程序性细胞死亡中起到不可获缺的作用。综上所述，在本研究中选用C6细胞为体外研究模型，探究甘草黄酮提取物在胶质瘤细胞凋亡中的作用，为开发治疗胶质瘤新药物提供数据支持。

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.2.1 细胞培养：（1）DMEM培养液：含10%新鲜的胎牛血清；（2）培养条件：37℃，5% CO2培养；

1.2.1 细胞培养：（3）细胞传代：细胞覆盖度至80%～90%左右用胰酶进行消化传代。

1.2.2 实验分组：实验分为空白对照组和实验组，实验组采用不同浓度的甘草黄酮提取物（药物浓度分别为20mM、40mM、80mM）处理C6细胞24h和48h。

1.2.3 CCK8法检测C6细胞活性：每孔接种5000个C6细胞于96孔板中，铺板80%左右开始给药。并且设置空白组（单纯DMEM培养液无细胞），周围补加PBS防止蒸发。待细胞贴壁后，将96孔板中的废液用1mL注射器吸出（吸出过程注意不要触碰孔板底部），每孔加入100μL10%CCK8溶液，孵育0.5h，用酶标仪检测波长为450nm处各组吸光度值，并计算细胞存活率。As：给药组OD值、Ac：Control组OD

值、Ab：空白组OD值。细胞存活率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%。将数据添加到GraphPad Prism 10.2.2软件中；计算IC50。

1.2.4 划痕实验计算细胞迁移率：6孔板中每孔接种2×105个C6细胞，当铺板达到90%左右时，用10μL枪头比着直尺垂直于孔板进行划线，用1mLPBS清洗2次后，加入1mL无血清DMEM培养液，在倒置显微镜下拍摄0h、48h细胞图片，放大倍数为40倍。Image J软件分析数据：细胞迁移率=（0h划痕面积-48h划痕面积）/0h划痕面积×100%。

1.2.5 利用蛋白裂解液提取总蛋白：六孔板每孔120μL-150 μL，轻摇晃动，全程冰上裂解15min，裂解完后用细胞刮将细胞刮下，收集于1.5 mLEP管中，12000r离心10min，取上清即为蛋白。利用BCA工作液测定蛋白浓度，并绘制标准曲线。

1.2.6 利用蛋白免疫印迹法检测凋亡蛋白表达情况。

（1）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳；

（2）转膜；（3）室温下5% BSA封闭；

（4）加入一抗，4℃孵育过夜；

（5）二抗孵育；

（6）用分析软件分析目的条带的相对灰度值。

2. 结果

2.1 甘草黄酮提取物对C6细胞形态的影响

Control组细胞形态饱满且舒展，呈纤维状，细胞间缝隙较小；与Control组相比，不同浓度甘草黄酮提取物干预随着时间增加，细胞间距变大，细胞数量减少，细胞变圆并且贴壁细胞背景模糊。

2.2甘草黄酮提取物对C6细胞增殖的影响

在不同浓度甘草黄酮提取物作用48h后，与空白对照组相比，20mM组细胞存活率降低（但没有统计学意义）；40mM组细胞存活率显著降低（p＜0.05）；80mM组细胞存活率显著降低（p＜0.0001）。利用Prism10.2分析数据得出细胞增殖曲线，获得半数抑制浓度（IC50）=46mM。

2.3 甘草黄酮提取物对C6细胞迁移能力的影响

在不同浓度甘草黄酮提取物作用48h后，与Control组相比，20mM组细胞迁移率降低（但没有统计学意义）；40mM组细胞迁移率有明显降低（p＜0.01）；80mM组细胞迁移率显著降低（p＜0.001）。

3.讨论

脑胶质瘤是最常见的原发恶性脑肿瘤之一，具有边界不清、毗邻功能区、放化疗不敏感等特点，手术切除困难，预后差。手术是胶质瘤治疗的第一步，但由于其浸润性生长特性，仍需放化疗作为辅助手段进行治疗，但术后患者存活率仍然不高[4]。

甘草黄酮提取物可以作为一种有效的治疗药物，减少不良反应和毒性，减轻患者疼痛，提高生活质量[5，6]。有研究表明，甘草黄酮提取物在卵巢癌等难治性肿瘤中均表现出显着的抗癌活性。在本研究中，我们以大鼠胶质瘤C6为细胞模型，通过给与40mM的甘草黄酮提取物，表现出了显著的抑制效果。通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达实现抑制C6细胞的增殖。

参考文献：

[1] Q.T. Ostrom， H. Gittleman， G. Truitt， A. Boscia， C. Kruchko， J.S. Barnholtz-Sloan CBTRUS statistical report： primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2011-2015 Neuro Oncol.， 20 （2018）， pp. iv1-iv86

[2] N. Zhang， L. Zhang， B. Qiu， L. Meng， X. Wang， B.L. Hou Correlation of volume transfer coefficient Ktrans with histopathologic grades of gliomasJ. Magn. Reson. Imag.， 36 （2012）， pp. 355-363

[3] Hillman G G， Singh-Gupta V. Soy isoflavones sensitize cancer cells to radiotherapy[J]. Free Radic Biol Med. 2011;51（2）：289-98

[4]邵颖颖.双氢青蒿素对脑胶质瘤细胞凋亡、迁移侵袭的作用及其机制[D].重庆医科大学[2024-05-30].DOI：CNKI：CDMD：1.1018.863760.

[5]Uckun FM， Narla RK， Zeren T， et al. In vivo toxicity， pharmacokinetics， and anticancer activity of 甘草黄酮提取物istein linked to recombinant human epidermal growth factor. Clin Cancer Res. 1998;4：1125–34.

[6] Hwang J.Y.， Park J.H.， Kim M.J.， Kim W.J.， Ha K.T.， Choi B.T.， Lee S.Y.， Shin H.K. Isolinderalactone Regulates the BCL-2/Caspase-3/PARP Pathway and Suppresses Tumor Growth in a Human Glioblastoma Multiforme Xenograft Mouse Model. Cancer Lett. 2019;443：25–33. doi： 10.1016/j.canlet.2018.11.027.

作者简介：于恒源，女，汉，吉林省伊通满族自治县人，硕士研究生，白城医学高等专科学校，讲师，研究方向：抗肿瘤分子机制研究。

课题来源（课题名称）：

2023年白城市科技局项目《甘草黄酮类提取物调控IGF-1激活线粒体通路抗胶质瘤生长的机制研究》（2023030）；

2024年白城市科技局项目《白城甘草提取物抑制胶质瘤C6细胞凋亡的机制研究》（2024021）；

2024年白城医学高等专科学校“白城甘草的研究与开发”项目《白城甘草黄酮类提取物抑制胶质瘤的机制研究》（BCGC202414）