三种常见乳酸菌吸附亚硝酸盐的研究

摘要：唾液乳杆菌、戊糖片球菌和短双歧杆菌是常见的乳酸菌。目前，乳酸菌的研究已经涉及到很多方面，包括其生态学、基因组学、代谢途径、功能性成分等等。近年来，随着环境污染和饮食结构的改变，亚硝酸盐的含量逐渐增加，引起了人们的关注，长期摄入亚硝酸盐会增加患癌症的风险。因此研究唾液乳杆菌、戊糖片球菌和短双歧杆菌吸附亚硝酸盐的能力，对于预防和治疗癌症具有重要意义。研究发现唾液乳杆菌、戊糖片球菌、短双歧杆菌吸附亚硝酸盐有一定效果，吸附效果受温度和吸附时间影响，在37℃、吸附2h的条件下，戊糖片球菌的吸附效果最好。

关键词：唾液乳杆菌；戊糖片球菌；短双歧杆菌；亚硝酸盐

1.概述

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是发酵糖类主要产物为乳酸的一类兼性厌氧、杆状或球状、无芽孢、革兰氏染色为阳性的细菌的总称[1]。其主要菌群包括：双歧杆菌属、乳杆菌属、片球菌属、乳球菌属、链球菌属和肠球菌属等[2]。乳酸菌在人和动物体内天然存在，分布于宿主的整个消化系统、粘膜层和皮肤表面，与宿主形成共生关系[3]。人体肠道内存在一类益生菌群称为乳酸菌，它是一种优势菌群，被广泛应用于食品加工和生产、保健品开发、疾病治疗以及微生态制剂等领域。

亚硝酸盐（Nitrite）是一种常见的食品添加剂， 存在于香肠火腿与腌制肉制品的发色和保藏性食品中。由于亚硝酸盐在食品中的广泛存在，摄入的亚硝酸盐在酸性条件下会与体内的生物胺结合形成亚硝酰胺，这是一种致癌物质[4]，同时人体大量摄入亚硝酸盐会使氧合血红蛋白中的二价铁（Fe2+）脱去电子而被氧化成高铁（Fe3+）血红蛋白，高铁血红蛋白对人体及其有害，浓度过高会导致机体和器官缺氧，可能导致高铁血红蛋白血症、食道癌和癌症等疾病，严重的会导致死亡。

2.材料与方法

2.1材料与仪器

唾液乳杆菌、戊糖片球菌和短双歧杆菌保藏于本实验室；MRS培养基、MRS肉汤（广东环凯微生物科技有限公司）；0.4%对氨基苯磺酸、0.2%盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠（配置的浓度为5mg/L的亚硝酸钠标准液、200mg/L的亚硝酸钠使用液）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、低速离心机TDL-40B、紫外可见分光分光度仪V-1000、气浴恒温振荡器、生化培养箱

2.2实验方法

本研究采用体外实验方法，根据文献报道的方法稍加修改[6]：在MRS平板上分别划线培养唾液乳杆菌、戊糖片球菌和短双歧杆菌，37℃活化48小时后挑取单菌落放入MRS肉汤中。在37℃下培养18小时后，用3500 r/min的离心速度离心10分钟，弃掉上清液。用无菌水洗涤两次后再次离心并备用。根据GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，NaNO2的含量检测方法如下：吸取2mL吸附后的上清液至50mL比色管中，随后加入2mL对氨基苯磺酸，摇匀后静置5min。紧接着加入1mL盐酸萘乙二胺溶液混匀，并加水至刻度线，静置15min。最后，在波长538nm处测定吸光度值，并使用标准曲线回归方程计算亚硝酸盐的含量。

3.实验结果

（1）亚硝酸钠标准曲线的绘制

使用移液管准确吸取不同体积（0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50、3.0、3.50mL）的亚硝酸钠标准液（相当于不同浓度），加入到50mL比色管中。每个比色管中加入2mL的0.4%对氨基苯磺酸，混匀，并静置3-5分钟。然后，加入1.0mL的0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，再次混匀，并静置15分钟。完成静置后，将零号比色管中的标准液装入比色皿中，以零点进行调零，并在538nm波长处测定其吸光度。然后，依次测定其他比色管中剩余标准液的吸光度，并进行三次平行实验，取平均值，最后绘制标准曲线。结果显示：相关系数R2>0.99，表明相关程度高。

（2）温度对菌种吸附亚硝酸钠的影响：

分别从三种菌种的MRS肉汤液体培养基中吸取培养好的菌液10mL加入到15mL的离心管中，3500 r/min 离心10 min，离心后使用无菌水清洗两遍，控制菌液浓度相同，接着向各离心管加入10mL的亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠浓度为200mg/L，分别放置在27℃、37℃、47℃的气浴恒温振荡器中培养吸附2h。吸附完成后，3500 r/min 离心10 min，取上清液检测亚硝酸钠含量。

试验结果显示：温度升高可以增强唾液乳杆菌、戊糖片球菌以及短双歧杆菌吸附亚硝酸钠的效果。这可能是因为温度升高提高了三种乳酸菌的生物活性，导致菌体表面暴露更多的活性位点，从而提高了菌株的吸附能力。

（3）时间对菌种吸附亚硝酸钠的影响：

分别从三种菌种的MRS肉汤液体培养基中吸取培养好的菌液10mL加入到15mL的离心管中，3500 r/min 离心10 min，离心后使用无菌水清洗两遍，控制菌液浓度相同，接着向各离心管加入10ml的亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠浓度为200mg/L，分别在37℃的气浴恒温振荡器中培养吸附2h、4h。吸附完成后，3500 r/min 离心10 min，，取上清液检测亚硝酸钠含量。

试验结果显示，通过延长吸附时间，可以在一定程度上增强唾液乳杆菌、戊糖片球菌以及短双歧杆菌对亚硝酸钠的吸附效果。这可能是因为三种乳酸菌主要通过胞外吸附的方式，利用细胞表面的官能团（如羟基、羧基等）和大分子物质（如多糖、蛋白质等）与亚硝酸盐离子结合，从而逐渐增加吸附量。当结合位点饱和时，吸附过程逐渐趋于平衡。

（4）不同菌种吸附亚硝酸钠的效果

分别从三种菌种的MRS肉汤液体培养基中吸取培养好的菌液10mL加入到15mL的离心管中，3500 r/min 离心10 min，离心后使用无菌水清洗两遍，控制菌液浓度相同。接着向各离心管加入10mL的亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠浓度为200mg/L，分别在37℃的气浴恒温振荡器中培养吸附2h。吸附完成后，3500 r/min 离心10 min，，取上清液检测亚硝酸钠含量。

试验结果显示，戊糖片球菌的吸附效果最好。戊糖片球菌为兼性厌氧菌，可能菌体表面的胞外多糖含量相对其他两种菌属的多，呈现出相对较好的吸附效果。

4.总结

试验表明常见的乳酸菌如唾液乳杆菌、戊糖片球菌、短双歧杆菌对亚硝酸盐的吸附能力较弱，唾液乳杆菌、戊糖片球菌和短双歧杆菌对亚硝酸盐的吸附能力与其细胞表面的官能团含量密切相关，它能够与亚硝酸盐中的阳离子结合，从而发挥吸附作用。提高温度可以增强菌种的活性，使菌体表面暴露更多的活性位点，从而提高菌株的吸附能力。未来可以使用钙离子和铁离子进行竞争性吸附试验，探究金属阳离子对乳酸菌的影响，需进一步深入探究乳酸菌对亚硝酸盐的代谢途径和作用机制，以期为临床治疗提供更准确、有效的方法。

参考文献

[1]Halttunen T. Removal of cadmium， lead and arsenic from water by lactic acid bacteria， F， 2008 [C]. Functional Foods Forum; Deparment of Biochemistry and Food Chemistry.

[2]Salminen S， Von Wright A. Lactic acid bacteria： microbiological and functional aspects [J]. 2004， 139（1-67.

[3]于雷雷. 植物乳杆菌CCFM639缓解铝毒性作用及机制研究[D].江南大学，2017.

[4]孔令杰，邓洁莹，吴莹等.发酵肉制品中微生物替代亚硝酸盐发色作用机理及应用研究进展[J].食品科学，2023，44（11）：301-308.

[5]张奕吉，杜磊，谢静莉.植物乳杆菌X7021吸附重金属和降解亚硝酸盐能力的研究[J].食品安全质量检测学报，2021，12（12）：4786-4792.

[6]刘鹏，张雯，欧杰等.植物乳杆菌对米酵菌酸的吸附特性研究[J].食品工业科技，2023，44（02）：299-306.

作者简介：方桂娇（2001-），女，汉族，籍贯：广东省揭阳市，本科在读，单位：广州工商学院工学院，研究方向：食品微生物，益生菌与环境污染物的研究。