基于响应面优化诺丽果发酵工艺

第一作者：林亿帆（2002-），男，专科在读生，研究方向：食品加工技术及质量管理。

*通信作者：李平凡，男， 1973.8-；四川资中人，教授，研究方向：发酵食品、食品加工与质量管理。

基金项目：粤教职函[2018]194 广东省二类省级品牌专业建设项目；2022年广东省教育厅普通高校重点领域项目2022ZDZX4066（科技服务乡村振兴）粤北三华李微醺果味米酒加工工艺创新和产业化示范 。

摘要：本文采用双歧杆菌探究外源菌种对诺丽果发酵的影响，根据诺丽果发酵液抗氧化能力作为主要判断依据，选择合适的发酵工艺条件，并得到抗氧化能力较强的诺丽果发酵液。通过响应面模型试验进行优化实验，进一步优化和改进诺丽果的发酵工艺条件。最佳发酵工艺参数为双歧杆菌接种量3%，发酵时间25d，发酵温度38℃，初始糖度为15%，料液比为1：1（g；ml）。诺丽果粉碎均匀后进行发酵，得到的诺丽果发酵液pH值为4.8、糖度为5.4%、黄酮含量为13.562mg/L，DPPH自由基清除率为69.538%。

关键词：诺丽果；工艺优化；

诺丽果主要产于南太平洋群岛，在我国则主要产自海南省。该果实具有消化、降血糖[[1]Lee H H， Yin L J， Tai H M， et al. Facilitating the release of bionutrients from Morinda citrifolia （noni） by cellulase hydrolysis and lactic acid bacteria fermentation and their effects on α-amylase and α-glucosidase activities[J]. Journal of Marine Science & Technology， 2016， 24.]等作用。以诺丽果作为原材料发酵得出的发酵液具有良好的抑菌作用。胡欣雅[[2]胡欣雅，谢晓晴，万家良等.一种诺丽果漱口水的制备及抑菌效果[J].轻工科技，2021，37（08）：8-9+25.]等人曾以此为原材料制作了诺丽果漱口水，刘倩等人试用不同菌种发酵对诺丽果酵素的抗氧化能力影响做出了研究[[3]刘倩，袁越，张杰，等不同菌种发酵对诺丽果酵素的抗氧化性及风味物质的影响[J/OL].食品工业科技：1-15[2022-10-04].DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2022040097.]。以其作为原材料发酵得出的发酵液具有良好的抗氧化性[[4]张清月，董姝慧，李胤豪等.诺丽果不同提取物抗氧化能力的比较研究[J].中国粮油学报，2022，37（05）：144-150.]。传统的诺丽果发酵时间长，产量不稳定，本研究选用双歧杆菌进行响应面优化发酵工艺，经过实验论证结果与响应面软件预估值近似，证明响应面优化方案可行。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1原材料

新鲜诺丽果，去离子水

1.1.2仪器与试剂

采用本实验室常用设备仪器。

1.1.3选用培养基

平板技术琼脂（PCA），细菌基础培养基（LB），胰蛋白胨培养基。

1.2工艺流程

设计发酵工艺流程：原材料处理→设定糖酸度→发酵罐进行高压灭菌处理（121℃，15min）→初次发酵→选定发酵条件进行响应面优化→二次发酵（25d，35℃）→发酵液用微孔滤膜过滤[[6]田亮，毛祥飞，景瑞雪等.诺丽果发酵过程活性及挥发性成分变化研究[J/OL].中国食物与营养：1-13[2022-10-04].DOI：10.19870/j.cnki.11-3716/ts.20210917.001.]→密封保存

1.3  发酵流程

将诺丽果洗净切块后漂烫30s，放入破碎机中打碎制成果浆，称取250g果浆放入事先高温灭菌的发酵罐中，加入250ml无菌水，用柠檬酸调节PH值，PH值控制在4.0-5.0之间，添加总质量3%的双歧杆菌，双歧杆菌在添加之前先用适量温度为25-35℃的温水活化30min。

2.  功能性检验

2.1  DPPH自由基清除能力测定

2.1.1 试剂制备

DPPH试剂：准确称取5.000mg的DPPH标准品，用无水乙醇溶解定容至100 mL，超声破碎15min间息2s功率100w得到质量浓度为0.050 mg/mL的DPPH标准溶液，使用前进行适当稀释，使试剂在波长517nm下吸光度为0.70±0.05，作为使用液。

2.1.2  样品溶液的制备

称取发酵液以及Vc溶解于无水乙醇中制成五个质量（体积）梯度浓度备用，见表1

2.1.3  抗氧化性检验

准确移取3.50 mL DPPH使用液于比色管中，分别加入500μL表1中发酵液溶液，避光静置30 min，无水乙醇为空白对照，在517 nm波长下测定各样液的吸光度A值。同时，以500 μL无水乙醇代替样品在相同的条件下进行测定，吸光度记为A0。平行测定3次，绘制清除率曲线。

将上述步骤中发酵液溶液替换成Vc溶液重复上述流程检测出Vc在不同浓度下的清除能力作为对照，按以下公式计算Vc和发酵液的半抑制率IC50值。

清除率= （A0-A）/A0*100%

式中：A0为DPPH的初始吸光度；A为加入样品溶液后DPPH的吸光度。

2.2  黄酮含量的检测

2.2.1  制定标准曲线

参考曹会凯[]方法，建立芦丁标准曲线。

2.3 评分依据

通过正交实验以发酵液对DPPH的清除率[]（以下称为抗氧化能力）作为主要判断依据，确定初步发酵条件。

2.3.1  发酵温度对抗氧化能力的影响

准确称取250g诺丽果打浆后添加去离子水，料液比为1：1（g：mL），双歧杆菌接种量为3%，初始糖度为15%，发酵时间为25d的条件下，分别选择发酵温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃进行发酵实验。发酵结束后用微孔滤膜过滤，密封保存。结合2.1.3步骤方法以抗氧化能力作为评价标准最后总结出最佳的发酵温度对诺丽果发酵汁液品质的影响。

2.3.2初始糖度对抗氧化能力的影响[]

准确称取250g诺丽果打浆后添加去离子水，在料液比为1：1（g：mL）酵母接种量为3%，发酵温度为35℃，发酵时间为25d的条件下，分别选取初始糖度为5%、10% 、15%、20%进行诺丽果发酵实验，发酵结束后用微孔滤膜过滤，密封保存。结合2.1.3步骤方法以抗氧化能力作为评价标准最后总结出最佳的发酵初始糖度对诺丽果发酵汁液品质的影响。

2.3.3  双歧杆菌接种量对抗氧化能力的影响

准确称取250g诺丽果打浆后添加去离子水，在料液比为1：1（g：mL），发酵温度为30℃，初始糖度为15%，发酵时间为25d的条件下，分别选择双歧杆菌接种量为1%、2%、3%、4%、5%进行诺丽果发酵实验。发酵结束后用微孔滤膜过滤，密封保存。结合2.1.3步骤方法以抗氧化能力作为评价标准最后总结出最佳的双歧杆菌接种量对诺丽果发酵汁液品质的影响。

3. 响应面优化实验

以单因素实验为实验基础[]，各个水平的因素进行三组平行实验，利用软件Design-Expert 11进行三因素三水平的响应面试验，同时进行回归分析，对每组因素进行分析，对发酵进程影响较大的因素及水平，进行响应面模型分析。

4.  结果与分析

4.1  诺丽果初步发酵条件确定

4.1.1  诺丽果发酵温度的初步确定

抗氧化能力在45℃达到顶峰。

4.1.2  诺丽果发酵中菌种的初步确定

在双歧杆菌接种量到达3%时该组的抗氧化能力最强。

4.1.3初始糖度的初步确定

在初始糖度为15%，其抗氧化能力最强。

4.2  响应面优化结果

4.2.1 数据分析

以上述单因素实验作为条件范围，进行响应面试验优化。结果见表3，分析见表4

拟合得到感官评分的二次回归方程：y=72.48+0.2050*A-0.0175*B++1.20*C-1.83*AB-1.57*AC-0.8675*BC-5.79*A2-4.02*B2-4.24*C2

由表6可以看出，抗氧化能力的回归模型极为显著（P＜0.000 1），决定系数R2=0.9844，调整决定系数R2Adj=0.9644，失拟项检验不显著（P= 0.3844＞5），说明该模型的拟合性较好，能够较好的反应3个因素之间的关系。一次项C对感官评分影响显著（P＜0.05）；交互项AB、AC及二次项A2、B2、C2对抗氧化能力影响极显著（P＜0.0001）。

4.2.2  响应面验证实验

由Design-Expert 11Trial软件提供的优化模型结果定为38.000℃，14.000%，接种量为3.000%。得到的发酵液色泽透亮，气味清香，重复2.1.3步骤得到自由基清除率达到了69.528%，与预估值相近。

4.3  黄酮含量的检测

通过2.3.1步骤取得的标准曲线，测定通过响应面优化得出的发酵液的黄酮含量，检测得出黄铜含量为13.562mg/ml。

5.参考文献

[1]Lee H H， Yin L J， Tai H M， et al. Facilitating the release of bionutrients from Morinda citrifolia （noni） by cellulase hydrolysis and lactic acid bacteria fermentation and their effects on α-amylase and α-glucosidase activities[J]. Journal of Marine Science & Technology， 2016， 24.

[2]胡欣雅，谢晓晴，万家良等.一种诺丽果漱口水的制备及抑菌效果[J].轻工科技，2021，37（08）：8-9+25.

[3]刘倩，袁越，张杰，等不同菌种发酵对诺丽果酵素的抗氧化性及风味物质的影响[J/OL].食品工业科技：1-15[2022-10-04].DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2022040097.

[4]张清月，董姝慧，李胤豪等.诺丽果不同提取物抗氧化能力的比较研究[J].中国粮油学报，2022，37（05）：144-150.

[6]田亮，毛祥飞，景瑞雪等.诺丽果发酵过程活性及挥发性成分变化研究[J/OL].中国食物与营养：1-13[2022-10-04].DOI：10.19870/j.cnki.11-3716/ts.20210917.001.