小檗碱对糖尿病大鼠膀胱收缩功能的影响

糖尿病膀胱病变（Diabetic Bladder Dysfunction， DBD）是糖尿病常见并发症之一，发病率高达 50% ，但因其起病慢、症状不明显，往往容易被公众忽视。DBD 特征表现为膀胱逼尿肌收缩力下降与膀胱感觉神经损伤，最终导致尿潴留及肾功能损害 [1]。DBD 是由于长期的高血糖导致支配膀胱的自主神经和膀胱逼尿肌本身功能受损，从而引发一系列膀胱储尿和排尿功能障碍。高血糖导致的细胞毒性、代谢紊乱和神经信号传导障碍等是其主要的发病机制，表现为膀胱壁增厚及排尿功能障碍。研究证实，DBD 发病机制至少涉及双重路径。其一，肌源性损伤：高血糖诱导膀胱平滑肌 M3 受体表达下调及钙信号紊乱，降低对胆碱能激动剂的反应性 [2]；其二，神经源性损伤：自主神经病变导致胆碱能神经递质释放减少，表现为电场刺激（EFS）反应减弱[3]。小檗碱（BBR）是异喹啉类生物碱，是中药黄连的主要有效成分，具有广泛的药理活性，既往研究多聚焦其降糖作用 [4]。近年发现 BBR可改善糖尿病神经病变 [5]，但其对 DBD 中肌源性与神经源性收缩功能障碍的调节作用尚未明确。本研究通过观察 BBR 对 DBD 大鼠逼尿肌药物刺激及神经电刺激反应的影响，旨在为 DBD 新靶点治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康 6 周龄雄性 SD 大鼠，体重 180～220g ，购自医科大学实验动物中心，许可证编号 SCXK（冀）2022-001，在室温 18～25^∘C 、相对湿度 50%～ 80% 的环境条件下饲养，饲养期间自由采食、饮水。

1.1.2 仪器与试剂 BL-420N 生物信号采集系统、ISO-100 电刺激器、超级恒温槽（成都泰盟软件有限公司）；pHSJ-3F 数字酸度计（上海雷磁仪器有限公司）；660 型血糖仪（江苏鱼跃凯立特生物科技有限公司）；链脲佐菌素 STZ（Sigma 公司）；BBR（东北制药集团）；卡巴胆碱（ABCR GmbH&Co.KG 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 SD 大鼠常规饲料适应性喂养 1 周后，给予高糖高脂饲料。4 周后禁食 ^12h ，以 1% STZ 溶液 35mg⋅kg^-1 腹腔注射，注射后继续禁食 12h，期间不禁水。72h 后从尾静脉采血，用 660 型血糖仪测定造模大鼠空腹血糖（FBG），凡血糖值 ≥13.8mmol⋅L^-1 的动物认为造模成功。实验分为 5 组，每组 10 只：空白对照（NC）组、糖尿病模型（DM）组和 BBR 低、中、高剂量（BBR-L、BBR- M、BBR-H）组。

1.2.2 膀胱条标本制备 大鼠颈动脉放血处死后，用 75% 酒精消毒腹部皮肤，沿腹白线纵行切口暴露膀胱，迅速取下膀胱，去除周围脂肪和结缔组织，用眼科镊和眼科剪去除膀胱内侧的粘膜层，避免损伤标本。膀胱体部沿膀胱纵切面切取3～4 个 2mm×5mm 的膀胱逼尿肌标本。将标本置于含 20ml 改良 K-H 液的浴槽中，施以 1.0g 前负荷。实验时，采用改良的 Krebs-Henseleit（K-H）溶液作为营养液。实验中，标本下端通过丝线固定在 L 型支架的卡槽处，另一端则通过丝线连接至张力换能器，标本尽可能靠近浴槽下端，并保证持续通气，水浴槽的温度维持在 37±0.5^cC 。在电场刺激实验中，需要注意标本位于两个刺激电极之间。

1.2.3 BBR 对卡巴胆碱诱发膀胱逼尿肌收缩反应的影响 标本平衡 45min 后建立卡巴胆碱累积给药的浓度 - 反应量效曲线，共进行 5轮。每轮量效曲线之间间隔 30min ；第 1 轮实验作为预刺激，结果弃掉。第 2 轮量效反应曲线作为空白对照，分别在进行第 3、4、5 轮的卡巴胆碱累积量效反应曲线前 20min ，将 1μmol⋅L^-1 、 10μmol⋅L⋅l 、30μmol⋅L^-1 的 BBR 加入浴槽溶液中，记录药物引起标本收缩反应情况。时间对照组给予等容积蒸馏水。

1.2.4 BBR 对电场刺激诱发膀胱逼尿肌收缩反应的影响 将标本在改良的 K-H 营养液中平衡 45min 后进行电场刺激（电刺激参数为电压80V 、波宽 0.1ms 、频率 16Hz 的刺激，激时程 10s，刺激间隔 3min ）。第一轮预刺激 45min 弃去不用。预刺激后反复冲洗，标本休息 30min 后进行第二轮正式刺激。在第二轮正式刺激 5-7min 标本产生稳定的收缩反应后开始计时，继续持续刺激 60min 。将此连续 60min 刺激的前 15min 作自身对照，每隔 15min 依次加入不同浓度（1、10、30μmol⋅L^-1 ）的 BBR，时间对照组给予等容积蒸馏水。记录给药前、后电刺激诱发膀胱逼尿肌收缩反应的平均值。

1.3 统计学方法 结果采用 SPSS 22.0 软件进行分析，药物和电场刺激诱发标本收缩反应的实验数据以实测值的 表示。各组间的数据比较采用单因素方差分析， P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BBR 对卡巴胆碱诱发膀胱逼尿肌收缩反应的影响 卡巴胆碱（ 0.01-30μmol⋅L^-1 ）使各组大鼠膀胱逼尿肌标本产生浓度依赖性收缩反应。持续进行 5 轮累计给药量效反应曲线无明显变化，证明标本可以按实验设计进行5 轮量效反应曲线的测定（数据略）。与空白对照组相比，模型组标本最大收缩反应 Emax 明显下降，同时半数有效浓度EC50 变大，结果见表1、图1 和表2。

表 1 BBR 对卡巴胆碱诱发膀胱逼尿肌收缩反应 Emax 的影响（x±s， ）

注： 与 NC 组 比 较， ^**P<0.01 ； 与 DM 组 比 较， #P<0.05 ，##P _<0.01 ；较 NC 组变化率 （%）=1 （ 该 组 值 - NC 组 值 ） / NC 组 值 × 100；较 DM 组恢复率 组值 - DM 组值 ）/（NC 组值 - DM 组值 ） ×100%

表2 BBR对卡巴胆碱诱发膀胱逼尿肌收缩反应 EC₅₀ 的影响（ ）

注： 与 NC 组 比 较， **P<0.01 ； 与 DM 组 比 较， #P<0.05 ，## P<0.01 ；较 NC 组变化率 （%）=[（ 该组 EC ₅₀ - NC 组 EC ₅₀ ） / NC 组EC₅₀]×100 ；较DM 组恢复率 （%）= [（DM 组 EC ₅₀ - 该组 EC ₅₀ ） / （DM组 EC ₅₀ -NC 组 EC₅₀）]×100

图 1 卡巴胆碱诱发大鼠膀胱逼尿肌收缩反应曲线

2.2 BBR 对电场刺激诱发膀胱逼尿肌收缩反应的影响 空白溶剂对电场刺激诱发的大鼠膀胱逼尿肌收缩反应无影响，实验条件下，入选的标本能稳定进行电场刺激试验（数据略）。DM 组电场刺激诱发标本收缩反应（ 3.02±0.46g ）显著低于 NC 组诱发的收缩反应（ 7.5±0.62g ）， P<0.01 。 0.1、1 和 3 mmol·L-1BBR 可剂量依赖性提高电场刺激诱发的糖尿病大鼠膀胱肌条收缩反应。 1mmol⋅L^-1 和 3mmol L^⋅1 的 BBR 显著兴奋电场刺激诱发的膀胱逼尿肌收缩反应，结果见表3、图2。

表 3 BBR 对电场刺激诱发膀胱逼尿肌收缩反应 Emax 的影响 ）

注：与 NC 组比较，与 NC 组比较， ^*P<0.05 、 ^**P<0.01 ；与 DM组比较，##P <0.01 ；较 NC 组变化率 （%）= [（ 该组值 - NC 组值 ） / NC组值 ]× 100 ；较DM 组恢复率 （%）= [（ 该组值 - DM 组值 ） / （NC 组值- DM 组值 ）]×100 。

3 讨论

本研究探讨了 BBR 对糖尿病大鼠膀胱逼尿肌收缩反应的影响。结果显示，卡巴胆碱稳定诱发 NC 组和 DM 组膀胱逼尿肌收缩反应，与 NC 组相比，DM 组逼尿肌收缩反应明显下降，Emax 降幅超过 50% ，同时 EC50 值显著增大，说明 DM 状态下存在膀胱功能障碍，同时电场刺激试验再次验证了该结果。DBD 是典型的糖尿病并发症之一，长期的高血糖导致支配膀胱神的自主神经和膀胱逼尿肌功能受损，从而引发膀胱功能障碍。试验结果印证了DBD 的典型特征，即高血糖一方面可能通过平滑肌 M3 受体表达下调和钙信号紊乱协同损伤肌源性调控系统，另一方面，神经源性传导通路障碍，如自主神经脱髓鞘及神经递质释放障碍也是其可能原因，最终导致膀胱收缩力进行性衰退。研究发现 [6，7，8]，高血糖对肌源性调控的损伤表现为双路径协同作用：一方面通过氧化应激 -PKCβ2 轴下调 M3 受体表达，另一方面扰乱钙稳态，导致钙瞬变幅度降低与 CaMKII-MLCK 信号传导障碍。这种受体 - 钙信号的耦合失调，共同削弱了逼尿肌对胆碱能刺激的响应能力。值得注意的是，BBR 的干预呈现剂量依赖性修复效应，且其作用机制与DBD 的双重病理高度契合。

不 同 浓 度 的 BBR 均 可 改 善 DBD 症 状， 研 究 发 现，BBR（ 3μ mol·L-1）可使逼尿肌收缩反应回复达 74.1% ，不同浓度的 BBR使 EC50 恢复率分别达 39.0% 、 66.6% 和 86.1% 。这种阶梯式改善可能与 BBR 激活 AMPK/PI3K-Akt 通路直接相关，该通路不仅增强膀胱平滑肌 GLUT4 膜转位改善糖代谢，更通过抑制 TGF- β 1/Smad3 信号延缓胶原沉积，从而逆转膀胱纤维化进程 [9]。在神经源性保护层面，电刺激实验进一步揭示中、高剂量 BBR 使神经源性收缩恢复率达49.55% 和 66.96% 。深入机制研究表明，BBR 能显著降低背根神经节中 TNF- ∝ 、IL-1β 等炎症因子水平（NF- κB 通路抑制），同时上调神经营养因子 NGF 及其受体 TrkA 表达，双途径促进胆碱能神经轴突再生与功能重建 [10]。这种对神经 - 肌肉单元的协同调控，解释了 BBR 在整体上改善膀胱动力的优越性。需指出的是，本研究虽证实了 BBR 对电场刺激诱发神经源性收缩反应的显著改善。

综上所述，本研究通过量化分析证实：BBR 以剂量依赖方式改善糖尿病膀胱功能障碍，其作用涵盖肌源性（CCh 诱导收缩恢复率达86.1% ）与神经源性（EFS 反应恢复率 66.96% ）双途径。这一发现为BBR 治疗 DBD 提供了实验依据，提示其可能通过干预糖代谢紊乱相关的核心病理环节（如膀胱纤维化与神经退变），为糖尿病并发症的药物开发提供新思路。未来需进一步解析 BBR 在神经 - 肌肉单元中的精准作用靶点。

参考文献

[1] 刘志达 ， 周立新 ， 王 颖 . 糖尿病膀胱病变中氧化应激与 M3 受体的关系 . 中国糖尿病杂志 . 2021; 29（3）： 201-205.

[2] 李 伟 ， 张建国 ， 赵志刚 . 糖尿病大鼠膀胱胆碱能神经传导障碍的电生理证据 . 中华泌尿外科杂志 . 2020; 41（5）： 378-382.

[3] 李 伟 ， 黄海燕 ， 陈 敏 ， 等 . 小檗碱通过 AMPK 通路改善糖尿病神经病变 . 中国药理学通报 . 2019; 35（8）： 1125-1130.

[4] 王 瑞， 刘 阳， 马晓峰. 糖尿病膀胱M3 受体密度变化与逼尿肌收缩功能的相关性 . 中华实验外科杂志 . 2022; 39（2）： 312-315.

[5] 张 琪 ， 周立新 ， 刘志达 ， 等 . 小檗碱通过 L 型钙通道调节膀胱平滑肌收缩 . 中国病理生理杂志 . 2021; 37（6）： 1093-1098.

[6] 刘洋， 王建华， 李静， 等 . 糖尿病膀胱病变中 M3 受体表达与钙调控紊乱的关联研究 [J]. 中国病理生理杂志， 2021， 37（6）： 1123-1129.

[7] 赵明， 孙伟， 陈红， 等. 高血糖通过 Ca²³ /CaMKII 通路损害膀胱平滑肌收缩功能 [J]. 中华泌尿外科杂志， 2020， 41（8）： 621-626.

[8] 陈立， 张涛， 周敏， 等. 糖尿病膀胱功能障碍中M3 受体- ∇⋅Ca² ⁺信号轴损伤机制 [J]. 中国药理学通报， 2022， 38（4）： 512-518.

[9] 张敏， 李伟， 赵红， 等 . 小檗碱通过 AMPK/PI3K 通路改善糖尿病大鼠膀胱纤维化 [J]. 中国药理学通报， 2022， 38（3）： 412-418.

[10] 李志华，王雪， 刘强， 等 . 小檗碱调控 NGF/TrkA 通路修复糖尿病大鼠膀胱神经支配功能 [J]. 中国病理生理杂志， 2021， 37（8）：1432-1438.

[11] 陈阳， 赵峰， 孙明， 等. 小檗碱多靶点治疗糖尿病并发症的研究进展 [J]. 中国中药杂志， 2020， 45（16）： 3785-3792.

基金项目：河北化工医药职业技术学院院级课题（项目编号YZ2023002）

作者简介：卢海刚（1976-），男，药理学博士，主要从事老年病药理方面研究