基于网络药理学和分子对接研究杜仲壮腰汤治疗绝经后骨质疏松症

绝经后女性因雌激素保护作用缺失引发的骨质疏松症（PMO） 本质是骨代谢失衡的全身性疾病。其特征性改变包括： 骨量加速减少、骨小梁微架构塌陷及骨基质矿化异常，共同促成骨脆 ，进而显著诱发椎体、髋部等部位的低创伤性骨折[1]。作为绝经后女性最常见的骨质疏松类型，PMO 是全球中老年女性骨折、致残及生活质量下降的主要因素，65 岁以上人群患病率超30%。现有治疗药物（如双膦酸盐、RANKL 抑制剂）易引发血栓、胃肠道反应等不良反应，亟需开发更安全的替代方案[2]。

杜仲壮腰汤以盐杜仲、续断、菟丝子为主药，配伍黄芪、当归、熟地黄、醋龟甲滋阴补血，辅以补骨脂、肉桂、制附子、巴戟天、肉苁蓉温补肾阳，佐桑枝、泽兰祛湿通络。全方共奏补肝肾、壮筋骨、益气血、调阴阳之效。现代药理研究表明，滋补肝肾类方剂可通过调节内分泌、增强骨显微结构、提升骨密度与骨强度防治骨质疏松[3]。本研究结合网络药理学与分子对接技术，旨在系统分析杜仲壮腰汤的活性成分、作用靶点及通路，探索其治疗 PMO 的机制，为后续研究提供理论依据。

1 方法

1.1 ​ 活性成分与靶点筛选

基于 TCMSP 数据库，以口服利用度（OB）≥30%​ 与类药性指数（DL）≥0.18​ 为筛选标准，鉴定杜仲壮腰汤 14 味药材（含盐杜仲等）的活性成分。通过该库靶点预测模块获取成分靶点，经Uniprot 数据库统一基因命名并去重。1.2 ​ 疾病靶点整合

以“postmenopausal osteoporosis”为关键词，检索 GeneCards（筛选 Relevance score > 2）、OMIM（Gene Map 模块）及 GEO 数据库，整疾病靶点后经 Uniprot 标准化基因命名。

1.3 关键靶点筛选与网络构建

1.3.1 交集靶点 ：取药物靶点与疾病靶点交集，构建 Venn 图；多维网络 ：采用 Cytoscape 3.9.1 构建“药物-成分-靶点”互作网络，通过 Network Analyzer 计算拓扑参数（以 Degree 值为核心）。1.3.2 PPI 网络 ：交集靶点导入 STRING 数据库（物种：人；互作置信度≥0.7），利用 CytoHubba 插件（MCC 算法）筛选 Top5 核心靶点。

1.4 ​ 功能富集与分子对接

1.4.1 GO/KEGG 分析 ：使用 R 4.1.2 对共有靶点进行基因本体（GO）功能注释及KEGG 通路富集，并通过 ggplot2 等包实现可视化；1.4.2 分子对接验证 ： 配体处理 ：提取活性成分 mol2 文件→Chembio3D 能量优化→AutoDockTools 加氢/电荷计算/旋转键设定→生成 pdbqt 格式；受体处理 ：PDB 下载人源靶点蛋白→PyMOL 去除杂分子→AutoDockTools 加氢/电荷计算→生成 pdbqt 格式；对接参数 ：POCASA 1.1 预测结合口袋，格点盒子 60×60×60ų（间距 0.375Å）；对接分析 ：AutoDock Vina 1.1.2 完成对接→PyMOL 解析氢键/疏水作用模式。

2 研究结果

2.1 杜仲壮腰汤活性成分及靶点预测

通过TCMSP检索，以OB≥30%并剔除无效成分后，筛选收集到巴戟天65个成分、当归11、杜仲85、附子55、黄芪47、肉苁蓉42、肉桂8、桑枝16、熟地黄41、菟丝子16、续断19、泽兰11，将所有药物靶点合并去重得到208个靶点。

2.2 绝经后骨质疏松症相关靶点

通过GEO/GeneCards、OMIM数据库共获得绝经后骨质疏松症10896个靶点，将得到的基因经Uniprot数据库校正。通过韦恩分析整合药物潜在靶点与绝经后骨质疏松症（PMOP）相关基因，筛选出93个共有靶点（图1A），该靶点集表征了杜仲壮腰汤干预PMOP的关键作用靶标。

图1 A： 药物-绝经后骨质疏松症 VENN 图; B： 杜仲壮腰汤-PMOP-成分-靶点图：矩形表示靶点，椭圆形表示药物成分，菱形节点表示中药2.3药物-成分-疾病-靶点预测结果

基于药物-活性成分-靶点交互数据，创建 网络拓扑文件（network.xlsx） 与 节点属性文件（type.xlsx） ，导入Cytoscape 3.7.2构建可视化网络模型。该模型共包含 213个生物分子节点 及 517组互作关系，经拓扑分析（Degree算法）筛选出连接度最高的五种核心活性成分：β-谷甾醇（beta sitosterol）、金雀异黄素（genistein）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）和熊果酸（ursolic acid）（图1B）。

2.4核心靶点及网络相互作用

将药物与绝经后骨质疏松症靶点取交集获得93个共同靶点，导入STRING数据库（Homo sapiens，置信度≥0.7）构建蛋白互作网络，经Cytoscape 3.7.2可视化生成包含81个节点和498条边的PPI网络，采用CytoHubba的MCC算法筛选出前五位核心靶点：BCL2、CASP3、CCND1、EGFR、CTNNB1（图2）。

图 2 杜仲壮腰汤-绝经后骨质疏松症 PPI 图

2.5 生物功能富集分析

2.5.1GO 富集分析

取药物-疾病交集基因进行GO功能富集分析（DAVID数据库），筛选2188条条目（P<0.01）。主要涉及：生物过程（BP）（1948条）外源刺激反应、类固醇激素应答、化学应激反应、营养水平调节及氧应激响应（缺氧/氧化应激等）；细胞成分（CC） （87条）：膜筏、脂蛋白颗粒、分泌颗粒腔、转录调节复合物；分子功能（MF） （153条）：核受体活性、类固醇/转录辅激活子结合、DNA结合转录调控及半胱氨酸型内肽酶活性（图3A）。

图3 A： GO 柱状图; B： KEGG 气泡图： 通过对前 20 条 KEGG 通路的富集分析绘制气泡图：横轴为通路基因富集数量，气泡大小表示目标通路富集基因数，色阶由绿至红反映 P 值递减（显著性递增），圆圈面积代表通路关联基因数量分布。2.5.2KEGG 通路富集分析

通过 DAVID 数据库富集分析获得 151 条药物-疾病相关通路，按 P<0.01 筛选出 117 条显著通路，包括：AGE-RAGE、FoxO、TNF、PI3K-Akt、甲状腺激素、HIF-1、雌激素信号通路及甲状旁腺激素合成等关键通路（图3B）。

2.6 分子对接结果

分子对接显示Top5核心靶点（BCL2、CASP3、CCND1、CTNNB1、EGFR）与高活性化合物自发结合（结合能均<0，稳定性随负值增大而增强），各复合物均嵌入靶蛋白活性口袋：Ursolic acid与BCL2的GLU-97形成氢键（2.1Å）并与CASP3的PE-250结合（1.9Å）（图4A-B）；Genistein结合CCND1的GLN-183（2.4Å）和GLU-69（3.0Å、2.2Å）（图4C）；Kaempferol连接CTNNB1的ASN-516（3.3Å）、ARG-474（3.2Å）及ASN-430（双键3.2Å）（图4D）；Ursolic acid与EGFR的CYS-773形成氢键（2.3Å）（图4E）。

图 4 A：Bursolic acid 和 BCL2 组合相互作用模式图;B： Bursolic acid 和 CASP3 组合相互作用模式图;

： genistein和CCND1组合相互作用模式图;D： kaempferol和CTNNB1组合相互作用模式图;E： Bursolic acid和EGFR组合相互作用模式讨论

绝经后骨质疏松症（PMO）作为高发代谢性骨病，显著增加骨折风险并降低生活质量。鉴于现有长期治疗药物存在明显不良反应，系统研究中医药经典方剂（如杜仲壮腰汤）的作用机制具有重要价值。网络药理学分析显示该方核心活性成分为β-谷甾醇、金雀异黄素、山奈酚、槲皮素及熊果酸；实验证实山奈酚可通过上调β-catenin/Runx2/Osterix 通路促进成骨分化，同时抑制 RANKL-NF-κB-NFATc1 信号轴降低破骨活性，双向调节骨代谢平衡，从而起到防治骨质疏松的作用[11-12]。

通过蛋白互作（PPI）网络分析发现，BCL2、CASP3、EGFR 等靶点具有较高连接度（degree 值）。其中 BCL2 通过调控成骨细胞与破骨细胞的凋亡平衡影响骨稳态[13]——在成骨细胞中，BCL2 高表达可延长细胞寿命促进骨形成；而在破骨细胞中，其过表达反而延长细胞寿命并加剧骨吸收。值得注意的是，骨质疏松患者成骨细胞的 BCL2 表达显著降低，破骨细胞中却异常升高，动物实验进一步证实成骨细胞特异性敲除 BCL2 的小鼠会出现严重骨丢失[14]。表皮生长因子受体（EGFR） 作为 ErbB 酪氨酸激酶家族的关键调控因子，通过介导骨代谢稳态失衡参与骨质疏松病理进程。分子药理学研究证实，经典方剂四物汤可在转录水平增强 EGFR 表达，进而激活下游 PI3K/AKT 生存信号轴与 MAPK/ERK 增殖通路，显著促进成骨前体细胞 MC3T3-E1 的克隆形成能力[15]。这提示杜仲壮腰汤可能通过类似 EGFR 信号网络重编程机制调控骨代谢。

通路富集分析显示杜仲壮腰汤的核心作用集中于PI3K-Akt、MAPK 及 EGFR 信号枢纽。其中 PI3K-Akt 通路作为骨微环境动态平衡的核心调节器，通过磷酸化级联反应双向调控：一方面激活成骨分化关键转录因子（如 Runx2），另一方面抑制RANKL 诱导的破骨细胞生成[16-17]。值得注意的是， EGFR/PI3K 信号轴的协同激活在动物实验中使老年大鼠骨生物力学强度提升 45%，证实该通路对骨结构重建的关键作用[18]。

分子对接表明，杜仲壮腰汤的五种核心活性成分（熊果酸、金雀异黄素、山奈酚等）与关键靶点（BCL2、CASP3、CCND1、CTNNB1、EGFR）均实现自发结合 （结合能<0），且通过氢键、疏水作用等稳定嵌入靶蛋白活性口袋。这一结果具有三重意义：高亲和力验证负结合能证实复合物形成符合能量最低原理。尤其熊果酸与BCL2 的 GLU-97 形成短氢键（2.1Å）、与 CASP3 的 PE-250 结合（1.9Å），键长均小于 3.0Å的强相互作用阈值，提示结合稳定性高于常规药物-靶点相互作用[19]。靶点特异性证据 ：各成分结合位点均位于靶蛋白功能域——如 EGFR 的 CYS-773 是激酶活性中心的关键残基，熊果酸通过氢键（2.3Å）直接阻断其磷酸化，可能抑制EGFR 过度激活导致的骨吸收亢进[19-22]；而金雀异黄素结合 CCND1 的 GLN-183（2.4Å）和 GLU-69（3.0Å），可能干扰细胞周期蛋白复合物组装，抑制破骨细胞过度增殖。协同增效机制[21-22] ：山奈酚同时连接 CTNNB1 的 ASN-516、ARG-474 及 ASN-430（双键 3.2Å），形成多点锚定效应。CTNNB1（β-catenin）是 Wnt 通路的核心转录因子，其稳定化可激活Runx2/Osterix 成骨分化轴，而山奈酚的多残基结合可能增强 CTNNB1 蛋白构象稳定性，放大促骨形成信号[21-22]。

本研究不仅揭示了杜仲壮腰汤通过多靶点协 的现代药理学机制，更构建了“经典方剂-活性成分-信号网络-临床效应”的完整证据链，为开发兼具骨量提升与骨质量优化的新 代抗骨质疏松中药提供了关键科学依据。

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基金项目：泰州市中医药科技项目 TZ202406