实时荧光定量技术在食品微生物检测的应用

随着食品安全问题日益受到关注，建立高效、灵敏且可靠的微生物检测方法成为行业迫切需求。传统的培养法耗时较长且灵敏度不足，而常规 PCR 又存在术后处理复杂易导致污染等问题。在此背景下，实时荧光定量技术凭借其实时监测扩增过程、精确量化目标基因的特点脱颖而出。

一、实时荧光定量技术的原理

实时荧光定量技术（Real-timeFluorescentQuantitativeTechnology）以聚合酶链式反应（PCR）为基础，通过荧光信号的实时监测实现核酸定量分析。其核心原理基于荧光共振能量转移（FRET）与荧光探针特异性结合机制：在PCR 扩增过程中，引物与目标DNA 模板结合并延伸，嵌入反应体系的荧光探针（如 TaqMan 探针、SYBRGreen 染料）与扩增产物特异性结合；当 DNA 双链解旋，荧光探针被 Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性切割，荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光信号。仪器通过检测荧光强度的动态变化，利用 ^**Ct 值（循环阈值）** 与初始模板浓度的对数呈线性关系的特性，构建标准曲线，实现对样本中微生物核酸的绝对或相对定量。

二、技术优势

2.1 高灵敏度

传统培养法依赖微生物在培养基中的生长繁殖，检测限通常在10²-10³ CFU/g ，而实时荧光定量技术通过对核酸的直接扩增检测，可检测到 10CFU/g 以下的微生物，灵敏度提升 100-1000 倍。这种高灵敏度使其特别适用于低污染水平样品的早期预警，如生鲜农产品在冷链运输初期的微生物污染监测。

2.2 快速高效

传统培养法需经历样品富集、分离培养、生化鉴定等多个步骤，耗时长达 2-7 天；普通 PCR 虽缩短了检测时间，但仍需后续电泳等步骤进行定性分析。实时荧光定量技术整合了核酸提取、PCR 扩增与荧光检测于一体，从样品前处理到结果输出仅需 4-6 小时，较培养法缩短80% 以上，极大满足了生鲜食品、即食食品等对快速检测的需求。

2.3 准确定量

普通PCR 仅能实现定性检测，无法确定样品中微生物的具体含量；而实时荧光定量技术通过标准曲线构建，可实现对目标微生物的绝对定量。在优化实验条件下，其定量误差可控制在 10% 以内，为食品生产企业评估污染程度、制定风险控制策略提供了精确的量化依据。

2.4 自动化程度高

实时荧光定量技术采用 96 孔板或 384 孔板进行高通量检测，配合自动化核酸提取仪和荧光定量 PCR 仪，可同时处理数十份甚至上百份样品。整个检测过程可通过软件预设程序自动运行，减少了人为操作带来的误差，同时提高了检测效率，适合大规模样品筛查。

三、在食品微生物检测中的具体应用

3.1 食源性致病菌检测

3.1.1 沙门氏菌检测

沙门氏菌的 invA 基因作为高度保守序列，是理想的检测靶标。采用 TaqMan 探针法，该技术可在肉类样品中实现 5CFU/g 的检测限。某研究团队对 100 份鸡肉样品进行检测，结果显示，实时荧光定量技术与传统培养法的阳性符合率高达 100% ，但检测周期从传统方法的 48 小时大幅缩短至5 小时。

从技术原理来看，TaqMan 探针的 5^′ 端标记有报告荧光基团（如FAM），3' 端标记有淬灭荧光基团（如TAMRA）。在PCR 反应过程中，当引物与模板 DNA 结合并延伸时，Taq 酶的 5"3" 外切酶活性会将探针降解，使报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，释放出荧光信号，通过实时监测荧光强度即可实现对沙门氏菌的定量检测。

3.1.2 大肠杆菌 O157:H7 检测

rfbE 基因作为大肠杆菌 O157:H7 的特异性基因，是检测该致病菌的关键靶点。通过结合免疫磁珠富集技术，能够有效去除生菜等果蔬样品中的基质干扰，提高检测的准确性和灵敏度。

免疫磁珠富集技术利用抗原 - 抗体特异性结合的原理，将磁珠表面偶联针对大肠杆菌O157:H7 的特异性抗体。当含有目标菌的样品与磁珠混合时，抗体与大肠杆菌O157:H7 结合，在外部磁场作用下，带有目标菌的磁珠可快速分离出来，实现对目标菌的富集。

3.1.3 金黄色葡萄球菌检测

nuc 基因编码的核酸酶是金黄色葡萄球菌的特异性蛋白，针对该基因设计引物进行特异性扩增，可实现对乳制品中金黄色葡萄球菌的精准定量。其定量范围为 10-10⁶CFU/mL ，能够快速判断样品是否符合食品安全标准。

在实际检测中，通常会采用双重荧光定量 PCR 方法，同时扩增nuc 基因和金黄色葡萄球菌的另一个特异性基因（如 femA 基因），通过双重验证进一步提高检测的准确性和可靠性。

3.2 真菌及真菌毒素产生菌检测

3.2.1 黄曲霉检测

aflR 调控基因是黄曲霉产生毒素的关键调控基因，针对该基因设计引物进行检测，在花生样品中的检测限可达 10CFU/g 。研究表明，该方法的检测结果与黄曲霉毒素检测结果的相关性高达0.92，可在一定程度上替代成本较高的毒素检测方法，为花生等农产品的真菌毒素风险评估提供了一种经济、高效的检测手段。

在实际应用中，为进一步提高检测的灵敏度和特异性，可采用巢式实时荧光定量 PCR 技术。首先利用外侧引物进行第一轮 PCR 扩增，然后以第一轮扩增产物为模板，使用内侧引物进行第二轮实时荧光定量PCR 扩增。这种两步法扩增能够显著提高对低浓度黄曲霉的检测能力，尤其适用于真菌污染初期的快速检测，有助于及时发现潜在的食品安全风险。

3.2.2 霉菌总数快速筛查

采用通用引物扩增真菌 18SrRNA 基因，结合 SYBRGreen Ⅰ荧光染料法，可在 3 小时内完成粮食样品中霉菌总数的定量检测。该方法能够快速判断粮食是否存在霉变风险，为粮食储存、加工企业提供及时的质量预警，有助于减少因霉菌污染导致的粮食损失和食品安全问题。

SYBRGreenⅠ荧光染料能够与双链DNA结合，在PCR扩增过程中，随着双链 DNA 的合成，染料与 DNA 结合并发出荧光信号，荧光强度与扩增产物的量成正比。通过实时监测荧光强度，即可实现对霉菌总数的定量分析。这种方法操作简便、成本较低，适用于大规模样品的快速筛查。

结语：

实时荧光定量技术凭借快速、灵敏、定量的优势，已成为食品微生物检测的核心技术，在食源性致病菌筛查、腐败预警、毒素风险评估等方面发挥着不可替代的作用。其应用有效缩短了检测周期，提升了食品安全风险管控的时效性。

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