高效液相色谱法测定水产品中生物胺含量的方法优化

前言

生物胺是胺类化合物的总称，具有一定的生物活性，在生物体中发挥着重要的作用，生物胺主要由具有氨基酸脱羧酶活性的微生物对食品基质中的氨基酸的脱羧作用产生。适量的生物胺含量，能调节人体中核酸与蛋白质合成及生物膜稳定性的作用，过量的生物胺含量会使生物体的解毒系统功能受到伤害，在体内聚集过多，导致一系列中毒现象，产生一系列不良反应，所以，生物胺是能反映食品安全性的重要指标之一。生物胺存在于奶制品、肉制品、水产品等富含蛋白质的食品中，其中，水产品脂肪含量低，富含氨基酸、脂肪酸等优质营养物质，水产品的加工和储藏条件不当，将会产生大量生物胺，从而危害消费者的生命安全，所以，生物胺是水产品的重要安全危害因素之一，通过监测水产品的品质来控制生物胺的产生，保障公众的食用安全至关重要。

鲳鱼作为上等的食用经济海鱼，肉质滑嫩，刺少骨软，味道鲜美，营养丰富，在消费者中广受喜爱，尤其是老年人和儿童。鲳鱼虽鲜美，但稍有不慎，将会误食不新鲜的鲳鱼，带来中毒风险，本文将带鱼作为水产品研究对象，采用高效液相色谱法，配合柱前衍生的前处理方法，对冷藏条件中生物胺含量的变化分析研究，保障水产品的品质和食用安全。

国家标准 GB/T 5009.208 中液相色谱法是推荐的生物胺检测方法，但实验过程中样品前处理步骤较为繁琐，包含正己烷除脂、液液萃取、衍生后多次氮吹等步骤，涉及有机溶剂品种较多，对实验者身体有一定危害，并且，目标物响应值和重复性均不高，所以需对液相色谱法进行系列优化，翻阅大量文献，参考其他学者的经验，前处理步骤主要分为两个部分，样品的提取和衍生，所以，方法优化过程中，主要从两个关键点进行考察：提取液的优化和衍生液的优化，其中。衍生液的优化涉及衍生液的选择、衍生液的用量、衍生温度和衍生时间，优化实验条件，完善实验步骤，建立准确、快速、稳定的生物胺检测方法。

1 实验方法

1.1 实验步骤

称一定量绞碎的样品在离心管中，并放入1 颗陶瓷均质子，加10 mL 高氯酸溶液，于涡旋混匀仪中涡旋 20min ，4℃冷藏离心、转速：4000 r/min、时间：5 min，收集上清液，重复提取一次，合并上清液，将上清液收集于 25 mL 容量瓶中，高氯酸溶液定容。用移液枪分别吸取 1 mL 试样提取液和生物胺混标工作液于 5 mL 具塞试管中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 0.2 mL、饱和碳酸氢钠溶液 0.3 mL、 10mg/mL 丹磺酰氯衍生剂 1 mL，混匀，盖上塞子，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，40℃避光水浴 45 min，反应完毕后，加入 20 μL氨水终止衍生反应，避光静置 30min ，用乙腈定容至 3 mL，混匀，取适量溶液通过0.22 μm 滤膜，供液相色谱测定。

1.2 色谱条件

高效液相色谱仪型号：WATERS e2695 ；色谱柱：安捷伦 XDB-C18，4.6*250mm，5 μm ；色谱柱温度： 40^∘C ；进样量：50uL ；二极管阵列检测器；吸收波长：254nm ；流速：0.8mL/min ；流动相：0.005mol/L 乙酸铵溶液和乙腈梯度洗脱。

1.3 色谱测定

将一系列混合标准工作液的衍生液依次注入高效液相色谱仪中，测得目标化合物的峰面积，绘制标准曲线，将混合标准工作液浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标。

2 结果分析与讨论

2.1 提取液选择的优化

提取液选取了超纯水、高氯酸和盐酸溶液三种，考察其提取效果，结果发现，高氯酸对样品中生物胺含量提取效果最佳。超纯水作为提取剂时，无法将蛋白质沉淀，高氯酸和盐酸溶液虽然能沉淀蛋白质，但盐酸溶液提取后的样品溶液较混浊，4℃离心后，仍有些许浑浊，提取液损失较大，而经高氯酸溶液提取离心后的样品溶液，较为清澈，样品回收率高，可将样品进行有效的提取，所以，选择高氯酸溶液作为提取液。

2.2 衍生液的优化

2.2.1 衍生液选择的优化

衍生液选取了丹磺酰氯 Dns-cl 和邻苯二醛 OPA，比较发现，邻苯二醛 OPA衍生产物不稳定，重现性差，而 Dns-cl 衍生效果较好，衍生条件易控制，重现性好，峰形尖锐对称，未见前沿峰和拖尾峰。

2.2.2 衍生液体积的优化

衍生液的体积是影响衍生反应的重要因素，使用量较少，衍生不充分，影响生物胺含量的测定，使用量较多，会导致衍生剂的浪费，增加其他杂峰，所以，选取了 0.08mL、0.2mL、1mL、2mL 四个体积进行研究，结果发现，衍生液用量越大，衍生物的生成量也越大，但1mL 和2mL 衍生体积时，衍生物生成量接近，无明显变化。所以，选取1mL 的衍生体积最佳，节约试剂同时，衍生反应充分。

2.2.3 衍生温度和衍生时间的优化

衍生温度和衍生时间相互影响，温度越高，衍生所需的时间越短，高温虽然能缩短实验时间，但会导致衍生物峰型塌陷。选取常温反应 24h，40℃反应 45min， 60^∘C 反应 20min 三个衍生条件进行研究，研究发现，衍生物条件为60℃反应20min 时，目标衍生物响应最强，但组胺目标峰，峰型拖尾，不对性差。衍生条件为常温反应 24h 和 40℃反应 45min 时，都可得到最大衍生化，综合考虑，最终确定最佳温度为40℃下衍生45min。

2.2.4 冷藏储存条件对鲳鱼中生物胺含量的结果分析

鲳鱼样品经处理后在 4℃冷藏条件下储存 1d、5d、10d、15d、20d、25d、30d，运用本文建立的高效液相色谱法对生物胺含量随储存时间的变化进行相关分析。结果表明，储存1d 时，九种生物胺含量均为检出，储存到30d 时，腐胺、尸胺、酪胺、亚精胺和精胺含量均有变化，色胺、2- 苯乙胺、组胺和章鱼胺均为检出。其中，亚精胺和精胺增加缓慢，第 30d 时，含量均低于 10mg/kg。含量增加较为明显的是腐胺、尸胺和酪胺，第 5d 至第 10d 时，增加幅度最明显，其中，酪胺增长速度最快，增幅最大，达到 200mg/kg 以上，而腐胺和尸胺的累积含量不及酪胺含量的四分之三倍。随着储藏时间的增加，肉质趋于糜烂，气味趋于酸臭，从而生物胺总含量增加明显。

3 结论

本文在高效液相色谱法检测样品中生物胺含量水平的过程中，选择高氯酸溶液作为提取液，丹磺酰氯 Dns-cl 作为衍生剂，丹磺酰氯 Dns-cl 展示了优越的技术水平，显示了特别的优势，目标衍生物经过充分提取和柱前衍生后得到较好的分离效果，且稳定性较高，重复性高。本研究中对鲳鱼新鲜度和腐败进程随储存时间的增加进行相关研究，为水产品的品质变化规律及安全控制提供有力的理论支撑。然而，后期深入研究时，需注意实验环境对样品的腐败进程是否有影响，不同样品的腐败进程是否有差别。本研究发现，鲳鱼中的酪胺含量增加速度最快，建议将酪胺作为鲳鱼腐败过程中的标志物，更有效的把控鲳鱼的品质，监测其安全性能，为生物胺含量标准制定具有参考价值。

作者简介：王琳琳（1989-），女，汉族，江苏人，本科工程师，研究方向：食品质量与安全分析

通讯作者简介：卢竹阳（1992-），女，汉族，江苏人，本科工程师，研究方向：食品质量与安全分析