菠萝蛋白酶的提取及酶活力研究

一、引言

菠萝蛋白酶是存在于菠萝中的巯基蛋白酶复合体，具有广泛应用价值。在食品工业中，可用于肉类嫩化和啤酒澄清；在医药领域，具有抗炎、消肿及促进消化等功效。目前，菠萝蛋白酶的提取方法包括盐析法、超声辅助提取法、超滤法等。其中，盐析法因操作简便、成本低，在实验室和小规模生产中应用广泛，但优化提取条件以提高酶得率和纯度、明确活力影响因素仍是研究重点。本研究通过优化硫酸铵盐析法，系统分析环境因素对酶活力的影响，旨在为其工业化应用提供技术支撑。

二、材料与方法

2.1 实验材料

新鲜市售菠萝（成熟度适中、无腐烂）；硫酸铵、福林 - 酚试剂、酪蛋白等试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水为蒸馏水。

2.2 仪器设备

高速离心机、紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、冷冻干燥机、透析袋、电子天平等。

2.3 菠萝蛋白酶的提取

2.3.1 原料预处理

将菠萝去皮切块，称重后用高速组织捣碎机打浆，多层纱布过滤收集滤液。

2.3.2 盐析沉淀

在滤液中缓慢加入固体硫酸铵，设置 40% 、 50% 、 60% 、 70% 饱和度，搅拌溶解后静置过夜。次日离心收集沉淀，获得粗提物。

2.3.3 透析脱盐

粗提物用磷酸盐缓冲液（ 0.05mol/L ， pH7.0 ）溶解后，装入透析袋，透析并更换数次透析液，去除杂质。

2.3.4 冻干保存

透析液经冷冻干燥后获得蛋白酶粗品，密封低温保存。

2.4 酶活力测定

2.4.1 原理

福林 - 酚法基于酶催化酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸与福林 - 酚试剂反应生成蓝色化合物，在 680nm 处吸光度与酪氨酸量成正比，据此计算酶活力。

2.4.2 试剂配制

0.4mol/L 碳酸钠溶液、 Omega，0.2mol/L 三氯乙酸溶液，1% 酪蛋白溶液（ pH7.0 ）及稀释的福林- 酚试剂（现用现配）。

2.4.3 标准曲线制作

以不同浓度酪氨酸溶液显色后测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程。

2.4.4 样品测定

酶液与酪蛋白溶液在 30% 反应 10min 后，用三氯乙酸终止反应，离心取上清液显色，测定吸光度并计算酶活力。

2.5 活力影响因素实验

2.5.1 温度影响

设置 30-70℃梯度，测定不同温度下酶活力。

2.5.2pH 影响

用醋酸 - 醋酸钠、磷酸盐、Tris-HCl 缓冲液配制 pH5.0-9.0 溶液，测定酶活力。

2.5.3 金属离子影响

向反应体系中加入终浓度 1mM 的、、、、等金属离子溶液，测定酶活力变化。

三、结果与分析

3.1 提取结果

不同硫酸铵饱和度的提取效果如下：当硫酸铵饱和度为饱和度 40% 时，酶活力为 650U/mg ，得率为 120mg/100g 菠萝；当硫酸铵饱和度为饱和度 50% 时，酶活力为 710U/mg ，得率为 135mg/100g 菠萝；当硫酸铵饱和度为饱和度 60% 时，酶活力为 820U/mg ，得率为 145mg/100g 菠萝；当硫酸铵饱和度为饱和度 70% 时，酶活力为 720U/mg ，得率为 138mg/100g 菠萝。

结果表明， 60% 饱和度时酶活力最高（ 800U/mg ），得率达 150mg/100g 菠萝。过低或过高饱和度均导致活力和得率下降，可能与酶蛋白沉淀不充分或过度聚集变性有关。

3.2 温度对酶活力的影响

30{-}50% 时酶活力随温度升高递增， 50% 达峰值（设定为 100% 相对活力）；超过 50% 后活力显著下降， 60% 和 70% 时分别降至峰值的 70% 和 40% 。说明 50% 为最适温度，高温破坏酶蛋白空间结构导致失活。

3.3pH 对酶活力的影响

pH5.0-7.0 时酶活力随 pH 升高增加， pH7.0 时达最大值；pH8.0-9.0 时活力显著下降。这与酶活性中心氨基酸残基的解离状态受 pH 影响有关，中性条件下酶构象最稳定，催化效率最高。

3.4 金属离子的影响

使酶活力提高约 15% ，导致活力下降 30% ，、影响较小，有轻度抑制作用。推测稳定酶结构，而等重金属离子与巯基反应破坏活性中心。