白芍来源细胞外囊泡样颗粒的提取方法及活性评价

引言

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），是由细胞主动释放到胞外的脂质双层膜结构的微小囊泡的统称，可作为细胞间的媒介[1]。近年来，EVs 在生物医学领域研究中备受关注，尤其在疾病诊断[2]、治疗[3]和药物输送[4]方面的应用；而中草药（药用植物）EVs 更是成为新兴的热点领域[5]，诸多研究表明其具有多种生物活性，包括抗炎[6]、抗氧化[7]、抗癌[8]等。在此背景下，本文结合实际项目对于白芍来源细胞外囊泡样颗粒（PRAEVLP）的提取方法及活性评价展开研究。

1 项目案例概述

本文研究案例为亿航生物与清华大学药学院开展的校企合作项目，共同研究中草药外泌体的天然功效，项目主要研究内容包括中草药外泌体提取工艺开发及功效评价方法、放大生产工艺开发、生物活性测试、细胞水平功效验证、建立实验室功效评价体系、体内动物试验及安全性评价等。

2 提取方法

PRAEVLP 超速离心提取方法：称取白芍饮片 50g ，漂洗干净，放入破壁机中，加入 500ml PBS浸泡过夜。第二天开启破壁机，先低速搅碎、再高速破壁得到白芍榨汁液。汁液通过300 目筛网过滤去除残渣，转入离心管中，4℃下差速离心，其步骤为 500g 、10min，2000g、20min，4000g、30min，10000g、60min。上清转入超离管中配平，使用超速离心机（贝克曼 XPN-100）配合水平转头（SW32Ti），设置离心力 110200g ，4℃离心 70min。用 1ml PBS 重悬沉淀，得到纯化的 PRAEVLP。按照《中草药细胞外囊泡研究与应用专家共识（2023）》[9]建议的质量控制，鉴定 PRAEVLP。

PRAEVLP 切向流超滤方法中的料液采用深层过滤膜包（科百特CDFCDCSD4047SP）进行澄清过滤，使用超纯水以流速 ⩽80mL/min 冲洗并排气，冲洗体积≥ 100L/m² ；然后用 PBS，pH7.4 的平衡缓冲液以流速 ⩽80mL/min 平衡，平衡体积 ⩾50L/m² ；平衡后进行料液澄清，流速 40mL/min，前端压力达到14.5psi 时更换膜包，直到料液澄清结束。

澄清料液使用中空纤维柱（截留孔径300kd，科百特 HFELAMO451030P）在切向流（英赛斯）设备上浓缩，设置参数见表 1；浓缩 10 倍后使用 0.2μm 滤器（科百特）过滤除菌，控制流速，前端压力达到14.5psi 时更换滤器，直到过滤结束。

3 PRAEVLP 生物活性评价

3.1 细胞毒性实验

此项实验所用细胞见表 2，复苏细胞后，待铺板率达到约 60⁰ 时，将其转移至 96 孔培养板中，并在恒温培养箱（Thermo，型号 150I）内，设定温度为 37^qC 、 CO₂ 浓度为 5% 的条件下培养过夜。

实验设置包括空白对照组、溶剂对照组、阳性对照组以及实验组。实验组设 8 个浓度梯度，每梯度 3 个重复。细胞贴壁 40%～60% 时给药。溶剂对照加 DMEM，阳性对照加 10% DMSO，实验组加含样品的培养液。空白对照无细胞，仅加培养液。培养 24h 后，弃上清，加 0.5mg/mL MTT 试剂（Sigma），避光孵育 4h， 。孵育后，弃上清，加 DMSO，测 490nm OD 值，根据公式（1）计算：

细胞相对活力 （%） ）=（样品孔OD−调零孔 OD）/（溶剂对照孔 OD−调零孔 OD∗100%

3.2 细胞增殖实验

将成纤维细胞悬液（5000 个细胞/孔）加入 96 孔板， ，预培养 24h。加入 1～10μL 不同浓度的测试物质，继续培养 24h_⨀ 。随后，每孔加入 10μL CCK-8 溶液（BMU106-CN，Abbkine），孵育 2h 。最后，用酶标仪在 450nm 处测量吸光度。

3.3 美白功效评价

按参考文献[10]的方法测定黑色素含量。黑色素细胞复苏后，铺板至 60% 时，转移至 6 孔板，37℃、 5% CO₂ 培养过夜。细胞铺板 40%～60% 时，分组添加药物，每组 3 个重复。空白对照组加2mL 培养液，阳性对照组加 2mL 含光甘草定（上海奥利）的培养液，样品组加 2mL 含测试样品的培养液，继续培养 24h 。

24h 后，弃培养液，PBS 洗涤一次。用 0.25% 胰酶消化黑色素细胞（ ），37℃消化1～2 分钟，终止反应后收集细胞至 1.5mL 离心管，10000RPM 离心 10 分钟，弃上清。加入 200μL 蒸馏水， 500μL 无水乙醇和乙醚，混匀后室温静置 20 分钟，3000RPM 离心 5 分钟，弃上清。加入 Δ_lmL 含 10% DMSO 的 1mol/L NaOH 水溶液， 80^∘C 水浴加热 40 分钟。热孵育后，取 200μ L 上清液至 96 孔板，在 405nm 处测 OD 值，每个模型测两次。根据公式（2）计算：

抑制率 （%） ）=（空白对照组−样品组）/空白对照组 ×100%

使用 GraphPad Prism 作图，结果以 Mean±SD 表示。采用双尾 t-test 进行组间比较，判断标准见表 3。

巨噬细胞复苏后，铺板至 60% ，转移到 6 孔板， 37^qC 、 5% CO₂ 培养过夜。弃旧培养液。空白对照组加 1.8mL 正常培养液，阴性对照组加 1.8mL 溶剂对照培养液，阳性对照组加 1.8mL 含 0.01%地塞米松（中检所）的培养液，样品组加 1.8mL 含测试样品的培养液。

给药后，继续 37% 、 5% CO₂ 培养 2h。各组每孔加入 200μL 含 1μg/mL LPS（Sigma）的工作液，再刺激培养 22h 孵育结束后，收集上清液，按照 IL-6 ELISA 试剂盒（Abcam）、TNF- ∝ ELISA 试剂盒（NOVUS）说明书进行ELISA 检测。根据公式（3）计算：

抑制率 （%） ）=（阴性对照组−样品组）/阴性对照组 ×100% 图、结果表示、统计分析以及判断标准（表 3）与 3.3 章节中相同。

3.5 抗皱功效评价

成纤维细胞复苏后，铺板至 60% ，转移到 孔板， 37^∘C 、 5% CO₂ 培养过夜。铺板 40%～60% 时，分组添加药物，每组 3 个重复。阳性对照组每孔加 2mL 含 TGF- （Peprotech）的培养液，样品组每孔加 2mL 含测试样品的培养液，空白和阴性对照组加相同量的培养液。

给药后，继续 37^∘C 、 5% CO₂ 培养 24h。除空白对照组外，其余组别均进行 UVA 辐照，辐照剂量为 30J/cm² ，辐照结束后，置于 37% 、 5% CO₂ 中继续培养 24h 孵育结束后，收集细胞培养上清液，按照 Collagen I ELISA 试剂盒（CUSABIO）说明书进行 ELISA 检测。根据公式（4）计算：

提升率 （%） ）=（样品组−阴性对照组）/阴性对照组 ×100% 作图、结果表示、统计分析以及判断标准（表 3）与 3.3、3.4 章节中相同。

3.6 抗氧化功效评价

角质形成细胞复苏后，铺板至 60% ，转移到 6 孔板， 37^∘C 、 5% CO₂ 培养过夜。铺板 40% ～60%时，分组添加药物，每组 3 个重复。阳性对照组每孔加 2mL 含 VE（中检院）的培养液，样品组每孔加 2mL 含测试样品的培养液，空白和阴性对照组加同等量培养液。

给药后，继续 37‰ 、 5% CO₂ 培养 24h 除空白对照组外，其余组别 UVB 辐照（ 。辐照后，PBS 清洗 3 次，每孔加 1mL 10μM DCFH-DA 探针， 37^∘C 、 5% CO₂ 培养 30 分钟。弃DCFH-DA，PBS 清洗 3 次，胰酶消化，PBS 清洗，加入 PBS 稀释，流式细胞仪检测。抑制率计算及统计方法同抗炎功效评价。

4 研究结果

本文研究策略如图 1 所示，一是采用金标准方法（超速离心法）提取 PRAEVLP，并多维度表征；二是评价 PRAEVLP 生物活性；三是采用切向流超滤方法和超速离心法分别提取 PRAEVLP，通过产量、稳定性、生物活性、成本等多方面对比两种方法的提取效果。

4.1 超速离心法提取 PRAEVLP 的鉴定结果

通过透射电子显微镜（TEM）对超离提取的 PRAEVLP 进行形态观察，可看到 PRAEVLP 直径分布 30～200nm 不等，为典型的茶托状形态，部分聚集呈粘连状态（图 2A）。通过 NTA 检测 PRAEVLP 的粒径分布范围在 30～500nm ，平均粒径 272.3nm ，峰值粒径 240.3nm ，粒子浓度 2.92e+12+/-2.81e+11particles/ml（图 2B）。通过 BCA 法测定 PRAEVLP 的蛋白浓度为 6.7mg/mL ，计算超离法提取的 PRAEVLP 蛋白颗粒比为 4.36e+11particles/mg。通过 SDS-PAGE 分析 PRAEVLP 蛋白条带主要出现在 60kd、45kd 及 25kd 处（图 2C）。

4.2 细胞毒性检测结果

对超离提取的 PRAEVLP 进行100 倍稀释，然后对倍稀释 7 个梯度，共计 个浓度梯度，分别在四种细胞上进行细胞毒性试验，为后续功效评价筛选安全浓度，结果详见表 4

PRAEVLP 在角质形成细胞和成纤维细胞中表现出低毒性，最大1%浓度细胞活力仍 >95% ；在黑色素细胞和巨噬细胞中表现出低毒性，细胞活力 >90% 的安全浓度分别为 0.125% 、 0.0625% 。

4.3 PRAEVLP 功效评价结果

4.3.1 细胞增殖

经过浓度梯度测试，PRAEVLP 在达到 20ug/mL 时，可显著促进成纤维细胞增殖（ 138.5% ， P<0 .01），且比对照组促增殖效果（ 122.2% ， P<0.01 ）要好，二者同样有显著差异（ P<0.05⋅ ），结果见图3F。

4.3.2 抗炎、美白、抗皱、抗氧化功效

抗炎效果：LPS 刺激后，NC 组 IL-6 和 TNF- ∝ 显著增加，确认刺激有效。PC 组（地塞米松）IL-6 和 TNF- ∝ 显著降低，证明阳性对照有效。PRAEVLP 组 IL-6 和 TNF-α显著下降，抑制率分别为 18.50% 和 65.21% ，P 值均 <0.001 （图 3A、图 3B），显示 PRAEVLP 具有抗炎作用。

美白效果：与 PC 组相比，PRAEVLP 组黑色素含量显著降低，抑制率为 10.19% ， P<0.05 （图 3C），表明 PRAEVLP 具有美白效果。

抗皱效果：NC 组 Collagen I 含量显著下降，证明刺激条件有效。PC 组（TGF-β1）Collagen I 含量显著上升，阳性对照有效。PRAEVLP 组 Collagen I 含量显著上升，提升率为 333.09% ，P<0.001 （图 3D），显示 PRAEVLP 具有抗皱作用。

抗氧化效果：NC 组 ROS 含量显著上升，证明刺激条件有效。PC 组（VE）ROS 含量显著下降，阳性对照有效。PRAEVLP 组 ROS 含量显著下降，抑制率为 37.04% ，P 值 <0.001 （图 3E），表明 PRAEVLP 具有抗氧化作用。

（A 为 IL-6 含量检测结果；B 为 TNF-α检测结果；C 为黑色素含量检测结果；D 为胶原蛋白 I 含量检测结果；E 为活性氧含量检测结果；F 为细胞增殖结果。）

4.3.3 切向流超滤法与超速离心法比较

使用切向流设备进行 PRAEVLP 多批次生产，与超离法进行对比，评估两种方法产量、稳定性、经济性，评价结果详见表 s_o

01），并且操作耗时显著少于超离法（见图 4），提高了经济性。

为了便于功效对比，选择 PRAEVLP 最具代表性的促增殖和促胶原蛋白 I 生成的功效进行对比评价（见图 5），以检验切向流超滤法和超离法提取的 PRAEVLP 是否有功效差异。结果显示，超离法和TFF 法提取的 PRAEVLP 均能显著促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白 I 分泌，二者之间效果无显著差异。

以上两项对比评估，认为切向流超滤法可替代超速离心法用于 PRAEVLP 的工业化生

5 结论

本文研究中成功提取了白芍来源的细胞外囊泡样颗粒（PRAEVLP），并对其活性进行评价。结果表明，PRAEVLP 具有良好的生物安全性，能够促进细胞增殖，在美白、抗炎、抗皱、抗氧化等方面具有显著功效，并在美容护肤和医疗领域均有应用潜力。通过切向流超滤方法可在保证生物活性的情况下，提高 PRAEVLP 产率，相较超速离心法具有突出优势；同时，本文也为进一步研究 PRAEVLP在其它方面的应用提供了参考依据。

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作者简介：于海伦，男，汉族，1984.07-，河北迁西人，本科，工程师，研究方向：生物医药、 外泌体研发