重组蛋白药物纯化流程中亲和层析条件参数调控探讨

引言：

多种疾病治疗里，重组蛋白药物有着重要意义。特别是在癌症、糖尿病以及免疫系统相关疾病范畴，已成为不可替代的治疗途径。对于重组蛋白生产过程，纯化难度不容小觑，往往得采用一系列庞杂的分离方法，而亲和层析，凭借自身高效和选择的特点，在大规模生产中普遍应用。亲和层析运用生物分子间特异性结合力达成分离纯化目的，可在复杂混合物当中高效完成重组蛋白的分离。在重组蛋白药物制造进程中，亲和层析条件参数显著左右纯化效果，即便流速、pH 值、离子强度、温度等因素只有微小变化，也会直接影响蛋白质结合与洗脱的效率。怎样科学地对这些参数加以调控，实现极致的纯化成果，属于现今生物制药领域亟待探索的研究课题。

重组蛋白是指采用重组 DNA 技术，对编码目的蛋白的基因进行优化修饰后导入宿主细胞内进行表达的蛋白。重组蛋白的生产分为上游表达与下游纯化两个部分，鉴于表达宿主中生物大分子的复杂性，蛋白纯化的挑战不言而喻，随着柱层析的发展，亲和层析技术现已成为分离纯化的中流砥柱[1]。

亲和层析进程里各条件参数对纯化成效有关键作用。流速是影响层析效果诸多关键因素中的一项，流速若过高，可能引起重组蛋白和亲和介质结合不全面，要是流速过低，极有可能让操作效率变得低下；pH 值跟离子强度的改变，能直接影响重组蛋白与亲和介质之间相互作用的力，由此影响到结合及洗脱的效率；温度对蛋白质的稳定性及亲和反应存在显著影响，适宜温度利于维持蛋白活性与稳定性，合理调配亲和层析的诸项条件，是强化重组蛋白纯化效果的关键环节 [6]。

1 流速的优化

亲和层析的流速优化是提高分离效率、纯度和目标物回收率的关键步骤，需结合层析介质特性、样品性质及实验目的综合调整。核心原则是在保证目标物与配体充分结合的前提下，尽可能提高效率。

1.1 上样阶段流速优化（关键步骤）

初始流速设定：参考层析介质说明书的推荐流速（如琼脂糖凝胶柱推荐 12mL/min），以此为基准进行调整。

1.2 洗涤阶段流速优化

洗涤目的是去除未结合的杂质，可适当提高流速（比上样流速高 20% 50% ），但需避免流速过快导致目标物被洗脱（尤其低亲和力体系）。

1.3 洗脱阶段流速优化

洗脱流速通常低于上样流速，保证目标物均匀洗脱，减少峰展宽（如琼脂糖柱洗脱流速可设为 0.5mL/min）。对于梯度洗脱，流速过快可能导致洗脱峰重叠，需根据峰型调整（峰型分散则降低流速）。

流速优化的核心是“平衡结合效率与实验效率”：上样阶段以“无穿透”为标准降低流速，洗涤和洗脱阶段在不影响纯度的前提下适当提高流速。实际操作中需结合介质特性和样品情况，通过小试验证（如不同流速下的穿透率、纯度检测）确定最佳条件。

2 pH 值和离子强度的调控

亲和层析中，pH 和盐浓度是影响目标物与配体结合/ 洗脱效率的关键因素，直接关系到分离纯度、回收率和特异性。优化需围绕“结合阶段增强特异性结合，洗脱阶段高效解离目标物”的核心目标，结合目标物与配体的相互作用类型（如静电作用、疏水作用、配位作用等）设计实验。

pH 主要通过改变目标物或配体的带电状态（影响静电相互作用）、蛋白质构象（影响结合位点暴露）来调节结合强度。

盐浓度主要通过调节疏水作用和静电作用影响结合：高盐抑制静电作用、增强疏水作用；低盐则相反。

pH 优化核心是通过调控带电状态增强结合 / 促进解离；盐浓度优化核心是调节静电与疏水作用的平衡。实际操作中需结合目标物特性（如 pI、稳定性）、配体类型（如抗体、金属离子、凝集素），通过梯度实验验证，最终实现“结合牢固、洗脱高效、纯度达标”的目标。

3 温度的影响与调控

亲和层析通过调控温度可调节目标物与配体的结合强度、分子扩散速率及稳定性，进而影响分离效率、回收率和特异性。

上样和洗脱温度可根据“增强结合”和“促进洗脱”的目的分别优化（即不同）；但实操中，为了简化流程、减少干扰并保证蛋白稳定性，通常选择一致的温度。若实验中发现结合或洗脱效率不佳，可在保证操作稳定的前提下，小范围尝试温差（如4℃上样 + 室温洗脱），但需严格控制变量验证效果。

温度优化的核心是“结合阶段选低温增强稳定性（热敏感体系）或室温提高效率（稳定体系），洗脱阶段适当升温促进解离”。实际操作中需优先保证目标物和配体的稳定性，再通过对比实验确定最佳温度（通常4℃或室温为首选），平衡回收率、纯度与实验效率。

结论

亲和层析在重组蛋白药物纯化里属核心技术，条件参数的调控对纯化效果的提高极为关键，对流速、pH 值、离子强度、温度等条件进行合理调控，可极大提高重组蛋白纯度、收率及效率。伴随新型亲和介质和优化技术不断拓展深化，亲和层析技术对重组蛋白药物生产将发挥更关键的作用。

参考文献

[1] 周娜娜 ， 王小艳 ， 张媛 ， 等 . 重组蛋白药物的生产技术进展 [J]. 生物技术进展 ，2021，11（06）：724-731.

[2] 李洪利，黄倢，周丽 亲和层析技术在现代蛋白质研究中的应用及新发展 海洋湖沼通报 2005（03）：86-94.

[3] 荆喆 ， 黄尚志 . 一种新的研究蛋白相互作用的技术 -- 串联亲和纯化[J]. 国外医学 （ 遗传学分册 ）.2004，（3） ：145-148.

[4] 温立斌 ， 何孔旺 ， 解建平 ， 等 . 免疫亲和层析纯化类猪圆环病毒P1[J]. 华北农学报 .2013，（z1） ：397-399.

[5] 姚利利 ， 席俊 ， 陈慧彬 ， 等 . 免疫亲和层析柱纯化大豆球蛋白多克隆抗体的研究 [J]. 中国食品学报 .2021，（6） ：296-300.

[6] 侯恒扬， 李子炀 ， 乔娟 接枝法制备大孔金属固定化亲和层析介质及其蛋白分离性能研究 分析测试学报 .2025，（7）：1237-1246.

作者简介：马瑞国（1977.11-），性别：男，籍贯： 辽宁省锦州市，民族： 满，学历： 硕士研究生，职称： 中级工程师，研究方向： 生物化学.