解决林格葡萄糖注射液的无水葡萄糖含量虚高问题

结论：通过实验发现，优化后的检测过程，适用于本公司生产的醋酸钠林格葡萄糖注射液检测，其无水葡萄糖含量超常的研究结果，因结果不准确，不存在质量风险。

本企业生产的林格葡萄糖注射液主要用于循环血容量及组织间液减少时细胞外液的补充及代谢性酸中毒的纠正，同时补给能量。本品属于复方制剂，其组份主要包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、醋酸钠、无水葡萄糖。本品的无水葡萄糖含量测定检验方法属于高效液相色谱法，系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。核心逻辑可简化为：流动相携带样品→在色谱柱内通过 “固定相 - 流动相分配差异” 分离组分→各组分依次进入检测器产生信号→通过数据系统定量分析。本方法使用示差折光检测器，示差折光检测器（RID）是高效液相色谱（HPLC）中常用的通用型检测器，通过连续测量纯流动相与含样品组分的流动相之间的折射率差值（Δn）实现检测，核心适用于无紫外吸收、无法用紫外检测器检测的化合物（如糖类、甘油、部分高分子化合物等）。另由于示差检测器响应值受流动相波动影响较大，故使用外标法对本品的无水葡萄糖含量进行定量检测。该方法由转出方实验室参考无水葡萄糖原料含量测定方法、EP10.2、BP2020、USP NF2021 中无水葡萄糖的含量测定方法开发，经过分析方法验证后通过 3 个批次的转移试验比对，将分析方法转移至本实验室。

但我司在本品近期的稳定性考察样品的检验过程中发现其无水葡萄糖含量测定结果异常增长，故开展以下研究：对无水葡萄糖含量结果异常的6 批样品从人、机、料、法、环、测各方面开展检测全过程的调查，发现供试品图谱与该分析方法首次转移至本实验室时的供试品图谱不完全一致，供试品图谱主峰前基线明显异常上升，经查询其他历史检测批次发现供试品图谱中葡萄糖主峰前有分离开的醋酸根峰，但本次检测中供试品图谱中葡萄糖主峰前均无醋酸根峰，故怀疑醋酸根峰被包裹进葡萄糖主峰从而导致供试品无水葡萄糖峰面积异常偏高，致使检测结果偏高，为证实该假设，取空白辅料溶液及供试品溶液各进样 1 针，叠加进样图谱可明显看到醋酸根峰出峰位置与供试品溶液中葡萄糖主峰出峰位置重叠，如下：

根据上述试验结果开展进一步分析，通常情况下，在高效液相色谱（HPLC）检测中，两峰分离度（R）的核心影响因素可归纳为色谱系统参数、色谱柱性能、流动相条件和样品与操作因素四大类，各类因素通过改变峰间距（保留差异）或峰宽（扩散程度）直接影响分离效果，其中流动相条件主要包含流动相组成（比例 / 类型）、pH 值、流速、缓冲盐或离子对试剂等，该参数为固定参数未发生改变，故可排查，其次样品与操作因素主要是人为差异导致，安排另一名人员进行复测，检测结果与初测结果一致。而色谱系统参数同样属于固定参数，但仪器间的差异无法排除，色谱系统中死体积是系统中不与固定相作用的流动相体积（如进样器、管路、检测器流通池、柱接头），当死体积过大时，组分在系统内滞留时间延长，纵向扩散加剧，导致峰展宽；同时，死体积会稀释组分的保留差异（非保留时间占比升高），峰间距相对缩小，最终降低分离度，故需开展进一步研究方可确认死体积对检测结果的影响。从 22 台检测仪器中筛选出最短路径连接管路的仪器开展复测，发现醋酸根峰与葡萄糖主峰有分离趋势，但仍有部分重叠的情况。

最终针对色谱柱性能开展排查，为排除柱效下降的可能性，故更换色谱柱进行实验，进样一针空白辅料溶液和1 针供试品溶液，查看醋酸根分离情况，如下图：

由图可见，尽管醋酸根峰与葡萄糖主峰分离开，但分离度约为1.2，仍存在分离效果一般的情况，且初测使用的色谱柱于 2021 年 07 月 26 日购入，至今仅使用 6 次，且理论板数符合要求，对照品溶液图谱中峰型正常（对照品溶液中无醋酸根峰），故推测导致该产品第 18 个月无水葡萄糖含量超常的可能原因是现有检测方法对色谱柱要求较高，方法耐用性较差，使用一段时间后的色谱柱便无法满足检测要求。为证实该推测，采购一根新色谱柱按照说明书进行活化平衡后，进样检测发现醋酸根峰与葡萄糖主峰明显分离开，主峰峰型较好，分离度达到 2.2，故找到根本原因为在色谱柱方面的方法耐用性差。

根据根因制定对应的措施，方法本身对色谱柱的要求过高，色谱柱（以钙型磺化交联苯乙烯 -二乙烯基苯共聚物为填充剂，推荐 CarboPac Ca²⁺ ， 300mm×8.0mm ， 6μm ）价格较为昂贵，故尝试通过样品溶液前处理除去醋酸根，从根本解决醋酸根和葡萄糖峰分离不开的现象。经查阅资料发现固相萃取小柱（SPE）是一种基于固相吸附剂与样品中目标物质 / 杂质间吸附 - 解吸差异，实现分离、纯化与富集的样品前处理技术，经过多家供应商咨询和筛选，最终选择 ProElut PXA—混合型强阴离子交换反相柱，其吸附剂为含亲水基团的聚苯乙烯 / 二乙烯基苯共聚物上键合季铵基团，粒径 50μm，孔径 80 Å，比表面积 800m² ，作用基团是季铵基团、苯基、乙烯基、吡咯烷酮基，完全解离时呈现阳离子态，可分离纯化酸性化合物，比如含有羧基、酚羟基的化合物，适用于醋酸的吸附保留。

首先将固相萃取小柱（ProElut PXA 混合型强阴离子交换反相固相萃取柱）按要求进行活化平衡，取 3ml 甲醇加入小柱，待自然流尽后，取 3ml 纯水加入小柱，自然流尽即得；取供试品 10ml，置100ml 量瓶中，用稀释剂定容至刻度，摇匀，过活化后的固相萃取小柱，取续滤液，即得供试品溶液。通过3 批次跨实验室的双人结果比对试验，醋酸根被除去，葡萄糖峰型较好，分离度均符合要求，检测结果的重复性准确且稳定。

为确认优化后的方法适用性，开展滤过吸附性、重复性、溶液稳定性、多批次实验。实验结果如下：a. 滤过吸附性

滤过体积为 0ml 与未过滤峰面积比值为 2.9% ，滤过体积为 2ml 、4ml、6ml 和 8ml 与未过滤峰面积比值均在 98.0% ~ .102.0% 之间；过柱前供试品溶液中主成分峰和醋酸峰未分开，滤过体积为 0ml 、2ml 的供试品溶液与前一份峰面积比值分别为 5.4% 、 1792.2% ，滤过体积为 4ml 、6ml 的供试品溶液主峰与前一份峰面积比值分别为 100.6% 、 99.9% ，滤过体积为 8ml 的供试品溶液主峰与前一份峰面积比值分别为 102.9%. 。综上所述，确定弃去体积为 4ml

b. 重复性