不同培养方式对雨生红球藻虾青素积累的影响

摘要：虾青素（Astaxanthin）作为一种强效抗氧化剂，广泛应用于保健食品、化妆品和医药行业。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）被认为是虾青素的最佳天然来源之一，其在胁迫条件下能积累大量虾青素。虾青素的工厂化生产通常依赖强光条件，这意味着在光照资源相对匮乏的地区进行生产时面临一定的挑战。为了解决这一问题，可以采用一种粘附培养的方式。这种方式在弱光的条件下促进了雨生红球藻的虾青素积累，相比于传统水培养方式表现出更高的生产效率和更低的生产成本。

关键词：雨生红球藻；滤膜粘附培养；虾青素

1.引言：

虾青素（Astaxanthin）是一种酮式类胡萝卜素，具有显著的抗氧化作用，能够有效清除活性氧（ROS）和自由基，进而减少细胞的损伤[1，2]。虾青素广泛存在于水生生物（如龙虾、鲑鱼）和微藻中，通常与蛋白质结合形成复合物，赋予这些生物体特有的红色或粉红色外观[1]。此外，虾青素在预防皮肤衰老、眼部疾病、免疫系统功能衰退等方面展现出潜力，其抗氧化能力远超维生素C、维生素E和β-胡萝卜素[3]。虾青素的这一特点使其在健康产品、功能性食品和化妆品领域具有广阔的应用前景[4]。

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis），是一种单细胞淡水绿藻，是目前已知最富含天然虾青素的藻类，雨生红球藻在胁迫条件下能够积累的虾青素可以达到细胞干重的3-5%[5]。在天然虾青素的工厂化生产中，雨生红球藻的培养主要有两种方式：开放式池塘和封闭式光生物反应器（PBRs）[6]。无论采用哪种方式，都需要强烈的光照条件来促进虾青素的合成。然而，考虑到中国东南地区等光照资源相对匮乏的地区，这种依赖强光的生产模式并不适用于这些区域，从而限制了虾青素的生产潜力。此外，现有的研究大多集中在高光条件下对雨生红球藻虾青素积累的探讨[7]，而在弱光条件下，也能促进虾青素的积累的方法尚未得到充分研究。为了进一步降低天然虾青素的生产成本，本研究探索出一种新型的培养方式即滤膜粘附培养，本研究主要探讨了这种培养方式相比传统水培养对雨生红球藻虾青素积累的影响。

2.材料与方法

2.1藻种来源及培养条件

雨生红球藻采用由宁波大学藻类保育实验室提供的NBU489 藻株。培养分两个阶段进行，第一阶段在1升气泡光生物反应器中培养，第二阶段将达到平台期的藻通过手动抽滤的方式匀速均匀的抽滤到直径为100mm，孔径为8μm的醋酸纤维素混合膜（MCE）后转移到吸水无纺布上，无纺布下端连接NBU3培养基，并在40、60、80和100 μmol m⁻² s⁻¹ 四组弱光照梯度条件下进行培养，光暗周期为12小时光照与12小时黑暗，培养温度为 23°C。

2.2实验流程

实验设置了四组弱光光照梯度（40、60、80和100 μmol m⁻² s⁻¹），每个光照条件设置两种培养方式（水培养、滤膜粘附培养）。每组设置三个平行。各处理均培养在培养箱中，在实验的第7天和第14天收集藻体进行冻干，冻干后称取干重为0.01g左右的雨生红球藻藻体测定虾青素含量。

虾青素测定方法：

对每个样品进行冻干后称取0.01g左右的藻体，并用 20mL 二甲基亚砜（DMSO）提取。使用分光光度计（Metash UV-6100A，中国）在 530 nm 波长（A530）处测量提取液的吸光度[8]。虾青素含量与 A530 之间的关系通过虾青素标准品（UV ≥ 98%，Solarbio）建立，虾青素的浓度通过以下公式计算：C（mg/L）= 8.0762 × OD530–0.2985，R2= 0.995。

2.3数据处理与分析

使用origin进行作图，使用 SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），采用 Fisher 最小显著差异（LSD）确定各组间的显著性。通过 Excel 中进行 独立样本T 检验以评估两组间差异的显着性（ p < 0.05）。使用Origin10.1.5软件生成图形。

3.结果与分析

3.1 不同培养方式下对雨生红球藻虾青素积累的影响

在不同光强下，滤膜粘附培养相较传统的水培养具有明显的优势。具体来说，滤膜粘附培养的虾青素积累较高，尤其是在实验组较高光强条件下（80 μmol m⁻² s⁻¹和100 μmol m⁻² s⁻¹）。这表明，在滤膜粘附培养中，藻类能够更高效地利用光合作用积累虾青素。这种优势可能与滤膜粘附培养提供的更高密度的藻细胞接触表面有关，膜粘附可以有效地增加光照的利用率，提高光合作用效率，进而促进虾青素的积累。

在较低光强（40 μmol m⁻² s⁻¹）下，滤膜粘附培养和水培养的差异可能不如高光强下明显，但滤膜粘附培养的稳定性和高密度培养仍然是其优势。在光周期为12小时光照，12小时黑暗的条件下培养第十四天，60 μmol m⁻² s⁻¹光照下的滤膜粘附培养组虾青素的积累就达到了藻细胞干重的3%。而同时期水培养组只能达到1.2%左右，滤膜粘附培养提高了虾青素积累的效率。

3.2粘附培养中滤膜不同孔径对雨生红球藻虾青素积累的影响

我们探究了滤膜粘附培养方式中不同孔径大小的滤膜对虾青素积累的影响。采用三组不同孔径的滤膜（1μm、3μm、8μm）。实验结果表明，雨生红球藻虾青素积累在不同孔径大小的滤膜之间无显著差异（P＞0.05）。这可能是由于雨生红球藻细胞的大小为8-30μm不等。1μm的膜孔径适用于较小的藻类细胞，这种紧密的限制可能使藻类能够集中吸收更多的光照并有效积累虾青素。对于光照强度的响应可能更加敏感，尤其在光强度较高时，可能促进光合作用效率。

3μm的膜孔径可能平衡了细胞密度和过滤效果。在该孔径下，藻类细胞有更多的空间进行生长，但膜的粘附效应较1μm膜略微降低。整体来说，3μm膜孔径可能提供了一个较为理想的平衡，使藻类细胞在光合作用与光照的利用之间获得较好效果。

8μm孔径膜：8μm的膜孔径适用于较大的藻类细胞，可能会导致细胞之间的接触面积较小，从而限制了膜粘附效应的发挥。尽管如此，这种较大的孔径可能会减少膜堵塞的风险，使得培养更为稳定。光照较强时，滤膜粘附培养的优势更为明显，尤其是在较高光强条件下。

4.结论

粘附培养方式为雨生红球藻的培养提供了一种高效且环保的解决方案。通过优化光照、培养基氮源的供应等因素，相比于传统水培养，粘附培养方式能够显著提高虾青素的积累效率。在未来的研究中，进一步优化粘附培养方式的设计和操作进行扩大培养，将有助于提高虾青素的工业化生产水平。

5.讨论

滤膜粘附培养与水培水相比，滤膜粘附培养通过提供一个粘附表面，使得藻类细胞能够更高效地吸收光能并积累虾青素。膜的存在有效地增强了光合作用的效率，提高了虾青素的积累效率。同时，滤膜粘附培养提高了单位面积下藻类密度，减少了藻类在液体培养中的沉降现象，从而更稳定地维持了生长和胁迫条件。

由于雨生红球藻具有两根鞭毛，在营养阶段的雨生红球藻具有蔽光性，

所以传统的水培养会导致藻类接受的光照不足，光利用效率较低，特别是在培养密度较高时，光穿透深度有限，导致光照不均。这种不均匀的光照分布会影响虾青素的积累。

总的来说，滤膜粘附培养在弱光的光照条件下，就能够显著提高虾青素的积累，在较高光强下表现更加突出。不同孔径膜的选择需要考虑到藻类的细胞大小等因素，综合对比来说，1μm孔径膜在虾青素积累方面较优。以上实验为雨生红球藻工厂化生产天然虾青素提供了新的思路。

参考文献

[1] Nishida Y， Berg P， Shakersain B， et al. Astaxanthin： Past， present， and future[J]. Marine Drugs， 2023， 21（10）： 514.

[2] Rao A R， Sarada R， Shylaja M D， et al. Evaluation of hepatoprotective and antioxidant activity of astaxanthin and astaxanthin esters from microalga-haematococcus pluvialis[J]. Journal of Food Science and Technology， 2015， 52（10）： 6703-6710.

[3] Che H， Li Q， Zhang T， et al. Effects of astaxanthin and docosahexaenoic-acid-acylated astaxanthin on alzheimer’s disease in APP/PS1 double-transgenic mice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2018， 66（19）： 4948-4957.

[4] Shah Md M R， Liang Y， Cheng J J， 等. Astaxanthin-producing green microalga haematococcus pluvialis： From single cell to high value commercial products[J/OL]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7.Astaxanthin-Producing Green Microalga Haematococcus pluvialis.

[5] Mota G C P， Moraes L B S de， Oliveira C Y B， 等. Astaxanthin from haematococcus pluvialis： Processes， applications， and market[J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology， 2022， 52（5）： 598-609.Astaxanthin from Haematococcus pluvialis.

[6] Yu B S， Hong M E， Sung Y J， et al. A green decontamination technology through selective biomineralization of algicidal microorganisms for enhanced astaxanthin production from haematococcus pluvialis at commercial scale[J]. Bioresource Technology， 2021， 332： 125121.

[7] Liu K， Lv R， Xing H， et al. Xanthosine-mediated modulation of haematococcus pluvialis growth and stress response under high light： Insights from physiological and transcriptome analysis[J]. Aquaculture， 2025， 599： 742156.

[8] Zhang Y， Ma R， Chu H， et al. Evaluation of the performance of different membrane materials for microalgae cultivation on attached biofilm reactors[J]. RSC Advances， 2022， 12（3）： 1451-1459.

李明洋，2000年4月出生，男，汉族，黑龙江省佳木斯市，硕士在读，藻类生理生态及资源化利用。