樱桃根癌病病原菌鉴定及基于拮抗菌剂的土壤生物修复技术研究

一、引言

樱桃作为一种经济价值较高的水果，在我国种植面积不断扩大。然而，樱桃根癌病的发生严重影响了樱桃的产量和品质，给樱桃产业带来了巨大的经济损失。樱桃根癌病又称樱桃冠瘿病，主要危害樱桃树的根颈部、侧根和支根，病部形成大小不等、形状各异的瘤状物，导致树体生长衰弱，甚至死亡。准确鉴定病原菌是有效防治樱桃根癌病的基础，而传统的化学防治方法容易造成环境污染和农药残留问题。因此，开展基于拮抗菌剂的土壤生物修复技术研究，对于实现樱桃根癌病的绿色防控和樱桃产业的可持续发展具有重要意义。

二、材料与方法

（一）材料

病样采集：在多个樱桃种植区采集表现出典型根癌病症状的樱桃树根癌组织，共采集病样 30 份。土壤样品：在病株根际土壤及健康植株根际土壤中分别采集土壤样品，用于拮抗菌的筛选和土壤微生物群落分析。培养基：准备 LB 培养基、NA 培养基、KB 培养基等，用于病原菌的分离培养和拮抗菌的筛选培养。

（二）方法

病原菌的分离与纯化：将采集的根癌组织用流水冲洗干净，在超净工作台中用 75% 乙醇消毒 30s，再用 0.1% 升汞消毒 5min ，最后用无菌水冲洗5 次。将处理后的组织切成小块，接种到 NA 培养基上，28℃恒温培养 3-5天。待菌落长出后，采用划线分离法进行纯化，得到单菌落。

病原菌的鉴定

形态学观察：观察纯化后病原菌菌落的形态、颜色、边缘、表面特征等，在显微镜下观察菌体的形态、大小、排列方式等。

生理生化特性测定：进行接触酶试验、氧化酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验等一系列生理生化试验，测定病原菌的生理生化特性。

分子生物学鉴定：提取病原菌的基因组 DNA，采用通用引物对 16SrDNA 进行 PCR 扩增，将扩增产物进行测序，与 GenBank 数据库中的序列进行比对分析，确定病原菌的种类。

拮抗菌的筛选：采用稀释涂布平板法从土壤样品中分离微生物菌株，将分离得到的菌株分别与病原菌进行平板对峙培养，观察抑菌圈的大小，筛选出对病原菌具有拮抗作用的菌株。

拮抗菌剂的制备：将筛选得到的高效拮抗菌株在液体培养基中扩大培养，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤后，制成一定浓度的菌悬液，添加适量的保护剂和载体，制备成拮抗菌剂。

土壤生物修复效果评估

病原菌数量测定：采用稀释涂布平板法测定施用拮抗菌剂前后土壤中病原菌的数量。

土壤微生物群落分析：运用高通量测序技术对土壤微生物群落结构进行分析，比较不同处理土壤中微生物的种类和丰度。

樱桃植株生长指标测定：在试验田中设置对照区和处理区，处理区施用拮抗菌剂，对照区不做处理。定期测定樱桃植株的株高、茎粗、叶片数、叶片面积等生长指标，评估土壤生物修复对樱桃植株生长的影响。

三、结果与分析

（一）病原菌鉴定结果

形态学观察：分离得到的病原菌在 NA 培养基上形成圆形、白色、边缘整齐、表面光滑的菌落，菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性。

生理生化特性测定：该病原菌接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，能

够水解淀粉，不能液化明胶，符合根癌土壤杆菌的生理生化特性。

分子生物学鉴定：16SrDNA 测序结果与 GenBank 数据库中根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的序列相似度达到 99% 以上，进一步确定樱桃根癌病的病原菌为根癌土壤杆菌。

（二）拮抗菌的筛选结果

从土壤样品中分离得到 126 株微生物菌株，通过平板对峙培养，筛选出 12 株对根癌土壤杆菌具有明显拮抗作用的菌株。其中，菌株 J-5 的抑菌圈直径最大，达到 25mm ，对其进行进一步研究和应用。

（三）土壤生物修复效果评估

病原菌数量变化：施用拮抗菌剂 30 天后，处理区土壤中根癌土壤杆菌的数量比对照区降低了 68% ，60 天后降低了 82% ，表明拮抗菌剂能够有效抑制土壤中病原菌的生长和繁殖。

土壤微生物群落结构变化：高通量测序结果显示，施用拮抗菌剂后，土壤中有益微生物如芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）的丰度显著增加，而病原菌根癌土壤杆菌的丰度明显降低。同时，土壤微生物群落的多样性和均匀度也得到了提高，说明拮抗菌剂能够改善土壤微生物群落结构。

樱桃植株生长指标变化：与对照区相比，处理区樱桃植株的株高增加了 15% ，茎粗增加了 12% ，叶片数增加了 20% ，叶片面积增大了 18% ，表明基于拮抗菌剂的土壤生物修复技术能够促进樱桃植株的生长发育。

四、讨论

本研究通过形态学观察、生理生化特性测定和分子生物学技术，准确鉴定了樱桃根癌病的病原菌为根癌土壤杆菌，为后续的防治研究提供了科学依据。在拮抗菌的筛选过程中，采用平板对峙培养法成功筛选出对根癌土壤杆菌具有高效拮抗作用的菌株 J-5，并制备成拮抗菌剂。土壤生物修复效果评估结果表明，该拮抗菌剂能够显著降低土壤中病原菌数量，改善土壤微生物群落结构，促进樱桃植株的生长发育。

拮抗菌剂发挥作用的机制可能包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗性等。在土壤环境中，拮抗菌通过与病原菌竞争营养物质和生存空间，抑制病原菌的生长；同时，拮抗菌能够产生抗菌物质，直接抑制或杀死病原菌；此外，拮抗菌还可能诱导樱桃植株产生系统抗性，增强植株对病原菌的抵抗力。

然而，本研究仍存在一些不足之处。在拮抗菌剂的制备过程中，保护剂和载体的选择还需要进一步优化，以提高拮抗菌剂的稳定性和有效性。在田间试验中，试验周期相对较短，需要进行长期的跟踪监测，以评估拮抗菌剂的长期防治效果和对土壤生态系统的影响。

五、结论

本研究明确了樱桃根癌病的病原菌为根癌土壤杆菌，成功筛选出高效拮抗菌株 J-5，并制备成拮抗菌剂。基于该拮抗菌剂的土壤生物修复技术能够有效降低土壤中病原菌数量，改善土壤微生物群落结构，促进樱桃植株的生长发育，为樱桃根癌病的绿色防控提供了新的技术手段和理论依据。在今后的研究中，需要进一步优化拮抗菌剂的制备工艺，开展长期的田间试验，为该技术的推广应用提供更完善的理论和实践支持。

参考文献：

[1]田小曼,李朝红.樱桃根癌病病原菌鉴定及防治药剂筛选[J].贵州农业科学,2021,49(06):56-62.

[2]冯钰梅.我国樱桃根癌病病原鉴定及生防初探[D].中国农业科学院,2023.DOI:10.27630/d.cnki.gznky.2023.000586.