芽孢杆菌菌剂常温保存细胞数变化的研究

摘要：芽孢杆菌菌剂产品可分为固态粉剂和液态水剂。其中，液态水剂有菌体细胞活性较强，生产成本较低，使用方面等诸多优势。为了更好地了解和掌握菌剂产品在常温保存期间芽孢杆菌细胞数量和芽孢转化情况，本研究考察了常温密封保存6个月过程中菌体细胞数和芽孢数的变化情况，得出枯草芽孢杆菌细胞数减少81.6%，芽孢转化率为88.9%；巨大芽孢杆菌细胞数减少85.3%，芽孢转化率为88.5%；解淀粉芽孢杆菌细胞数减少84.0%，芽孢转化率为88.8%的结论。

关键词：芽孢杆菌；芽孢；转化率。

芽孢杆菌菌剂在环保、农业及养殖业等诸多领域具有广泛的应用。工业生产的芽孢杆菌菌剂可分为固态粉剂和液态水剂。其中，液态水剂有许多优势，如菌体细胞活性较强，生产成本较低，使用方面等，为了更好地服务于广大使用者，菌剂生产企业及时了解和掌握菌剂产品在常温保存期间芽孢杆菌细胞数量和芽孢转化情况，制定必要的保护措施，延长微生物的使用周期具有较重要的实际意义。

芽孢杆菌为好氧微生物，氧对维持菌体活力至关重要，菌剂产品入库后，由于密封保存，使得环境中氧被逐步耗尽，加之微生物的代谢及产物形成，营养物质也会逐渐贫乏，环境会发生不利于维持细胞活性的一系列变化，细胞会休眠甚至死亡，使有效活菌数减少。本实验以枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为例，通过活菌计数及芽孢染色方法，观察菌剂在6个月内细胞数变化及芽孢转化情况。

1.分析方法

1.1菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；

巨大芽孢杆菌（Bacillus megamegalorum）；

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

以上菌种由本所菌种保藏中心提供。

1.2 培养基

芽孢杆菌培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏0.5g/L；pH7.0-7.2、发酵温度37℃。

1.3生物量测定

以OD值表示细胞数多少.

1.4 平板计数法

1.4.1原理：将菌液样品稀释后涂布在固体培养基表面，在37℃条件下培养，形成可见菌落，通过统计菌落数估算活菌数量。

·1.4.2步骤：

·梯度稀释：将样品依次进行系列稀释（如10·1～10··）；

·涂布平板：取适量稀释液涂布或倾注于无菌培养基表面；

·培养：在37℃温度下培养至菌落形成（通常36～48小时）；

·计数：选择菌落数量适中的平板（一般30～300 CFU），用计数器或菌落计数器统计。

·1.4.3结果计算：活菌数=涂布体积平均菌落数×稀释倍数·

1.5 芽孢染色法（孔雀绿染色法）

·1.5.1原理：利用孔雀绿对芽孢的亲和性，结合加热固定增强染色效果，脱色后用番红复染细胞质。

·1.5.2实验材料

染色剂：

孔雀绿染色液（甲紫溶液，pH 2.5～3.0）。

番红复染液。

·耗材：载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、生理盐水、擦镜纸等。

·仪器：显微镜（油镜）、恒温水浴锅（可选）。

1.5.3操作步骤·

·涂片制备：用接种环挑取斜面上生长的菌苔，在洁净载玻片上滴1～2滴生理盐水，将菌苔轻柔涂抹成薄层，自然干燥，通过火焰快速过两三次快速固定。

·初染：在涂片上滴加孔雀绿染色液，覆盖整个涂片，静置5分钟，将载玻片置于火焰上方摆动加热3～5分钟。

·脱色：用蒸馏水缓慢冲洗涂片，直至流出的液体无绿色为止。

·复染：甩干涂片后，滴加番红染色液，静置5分钟，用蒸馏水充分冲洗，甩干后晾干。

· 镜检：芽孢呈绿色，形状规则（圆形、椭圆形），通常位于菌体中央或一端，·菌体则被番红染成红色，无芽孢部分为红色背景。

1.6 芽孢杆菌细胞数降低率和芽孢转化率

细胞数降低率=（初始菌数－终了菌数）/初始菌数×100%；

芽孢转化率=（终了芽孢数－初始芽孢数）/终了芽孢数×100%。

2.结果与讨论

实验间隔一段时间取样测定，观察6个月内菌株细胞数量变化及芽孢转化情况，结果如下：

2.1 芽孢杆菌保存期内细胞数量的变化

2.2 芽孢杆菌保存期内芽孢转化的情况

2.3结论

从表1和表2分析得知，常温储存6个月后，三种芽孢杆菌的菌数及芽孢转化情况趋势相近。其中，枯草芽孢杆菌细胞数减少81.6%，芽孢转化率为88.9%；巨大芽孢杆菌细胞数减少85.3%，芽孢转化率为88.5%；解淀粉芽孢杆菌细胞数减少84.0%，芽孢转化率为88.8%。可见，在常温储存期间细胞数呈下降趋势，而随着条件的恶劣，将近90%的细胞转化成休眠体芽孢。

对于非芽孢型菌剂，常温储存期间则需要适当添加保护剂，如海藻酸盐、甘油等物质。通过研究对企业菌剂产品特性更加深了了解，为今后指导生产打下基础。

作者简介

姓名：李强，性别：男，出生日期：1973.3.23，民族：汉，籍贯：天津，职称：助理工程师，学历：大专，研究方向：发酵工程与代谢控制，所在省市：天津市