头孢氨苄的绿色酶法制备工艺研究

1、前言

头 孢 氨 苄：（6R,7R)-3- 甲 基 -7-[(R)-2- 氨 基 -2- 苯 乙 酰 氨 基 ]-8-氧 -5- 硫杂 -1- 双环 [4.2.0] 辛 -2- 烯 -2- 甲酸，为白色至微黄色结晶性粉末；微臭。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。本品能耐葡萄球菌所产生的青霉素酶，故对青霉素敏感或耐药的金葡菌均有良好的抗菌作用。对溶血性链球菌、肺炎球菌、淋病双球菌高度敏感，对大肠杆菌、肺炎杆菌、流感杆菌、奇异变形杆菌、痢疾杆菌等亦有较好的抗菌作用，但对绿脓杆菌，结核杆菌等则不敏感。本品具有口服吸收完全、毒性低，过敏及反应率低，不易产生耐药性等优点。本品可为治疗呼吸道感染的选用药物。对少数由革兰阳性球菌所致败血症和心内膜炎也有效，但不宜用于严重感染。

我国从上世纪 80 年代开始进行生物转化 β- 内酰胺类抗生素方面的研究，并取得了一些成果。但由于在酰化酶的提取、分离和固定化技术及产物、原料的分离回收技术等方面没有取得实质性的突破，难以形成技术及经济优势，因此也难以在生产中实际应用。

近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备头孢氨苄的技术水平也不断得到提高。目前，不仅在青霉素酰化酶的固定化技术方面取得了突破性进展，已经有性能稳定的工业用固定化酶制品在生产中得到广泛的应用［如德国 Boehringer Mannheim 公司生产的商品名为 En-Zygel 及名称为 pGA-150 和 pGA －450 的固定化酶；意大利米兰 Recordati 公司生产的固定化酶；德国 Rohm Pharma 公司生产的商品名为Eupergit 的固定化酶和荷兰 DSM 公司（原 Gist － Brocades 公司）生产的商品名为 Assemblase 的固定化酶等］，而且在反应底物、酶缩合条件以及产物分离技术等方面的研究也取得了重要进展，具备了大规模工业化生产的条件，在我国如何通过酶法来制备头孢氨苄亟待解决。

2. 实验部分

2.1 主要仪器与试剂

GC-2014C 气相色谱仪、LC-20 液相色谱仪：岛津仪器（苏州）有限公司；KF-1 型水分测定仪：上海市安亭电子仪器厂；SHZ-D( Ⅲ) 循环水式真空泵、DZF-6050 型真空干燥箱、DW-3 型数显电动搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司； YP10002 电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；四颈瓶，恒压滴液漏斗，普通玻璃仪器等。

2.2 实验

2.2.1 配制苯甘氨酸衍生物溶液：

洁净的反应瓶中加入纯化水 45ml. , 控制温度 10-30^∘C ，开启搅拌，加入苯甘氨酸衍生物18g，备用。

2.2.2 反应

洁净的反应瓶中加入纯化水 100ml ，控制温度 10-30^∘C ，开启搅拌，加入 7-ADCA15g。用氨水调 PH 至中性，控制温度 10-30% ，加入催化酶9g_∘ 。向反应瓶中加入苯甘氨酸衍生物溶液。计时反应至7-ADCA 残留（7-ADCA 残留 <3.0mg/ml⟩ )，过滤，收集催化酶。

液用酸调 PH0.8-1.5，加入 0.3g 活性碳，加入 0.3g 焦亚硫酸钠，搅拌 30 分钟将料液过滤脱色。结晶反应瓶加入 15ml 纯化水，控制温度 30-40% ，将脱色滤液滴加至反应瓶中，用氨水调节结晶液 PH3.0-4.0，控温30-40^∘C ，养晶30 分钟，用氨水调节结晶液PH4.8-5.6，降温，降温至 0-5^∘C ，养晶 60-120 分钟。

过滤洗涤干燥，过滤，用 40ml 纯化水，用 40ml 丙酮洗涤，真空干燥箱50-60℃干燥至水分合格

2.2.3 复盐制备及处理：

收集过滤水溶液，加入2.g 萘酚与 6ml 丙酮的溶解液，养晶2 小时，过滤，用 60ml 丙酮洗涤，抽干得复盐，待用。反应瓶中加入 30ml 纯化水，加入50ml 二氯甲烷，开启搅拌，加入复盐溶解，分相，水相待用（可加入脱色过滤后的结晶液中）。检测含量 >99.5% 。

2.2.4 酰化酶回收方法：

为了提高酰化酶的利用率，对固定化酰化酶进行过滤分离、洗涤，搜集后套用，回收率可达 95% 以上。

3、结论

该头孢氨苄的制备工艺以水为溶剂 7-ADCA 与苯甘氨酸衍生物在酰化酶的催化下，在常温常压下进行反应，使 7-ADCA 的转化率可以达到99％以上。反应结束后经过简单的后处理，将反应液进行过滤、结晶、离心、干燥得到头孢氨苄。本工艺反应过程不用有机溶剂避免了对环境的污染，母液中残留的产品再通过萃取分离结晶加以回收套用，提高了产品收率，降低了生产成本。

实现降解周期可根据不同需求人为可控采用先进的绿色生产工艺 - 酶法生产工艺，大幅减少溶媒使用量，大幅降低 VOC 排放，大大减少了有机溶媒使用量，降低废母液中 COD 排放。产品的质量指标、收率指标达到目前国内领先的水平，大幅降低生产成本，并且降低环保压力，大幅降低环保运行成本。

参考文献：

[1] 吴伟波，王旭，王娜，等。β- 内酰胺类抗生素酶促合成新进展（J），有机化学，2006，26（3）： 292～298

[2] 陈希杨，王普，应国清，等。酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展（J），浙江工业大学学报，2002，30（1）： 53～58

[3] 方长明，陈舒明，刘爱红。头孢氨苄的酶法制备工艺研究进展（J），中国医药工业杂志，2002，33（1）： 38～41

[4] 叶树祥，许成苗，王佳兵。固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究（J），2007，38（9）： 619～620

[5] 《中华人民共和国药典》2020 版二部