HPLC 法测定糖皮质激素类原料药中有关物质的研究

目前，糖皮质激素类药物的杂质分析主要依赖高效液相色谱法和液相色谱- 质谱联用技术。然而，现有方法多针对单一品种开发，通用性不足，对极性相近杂质的分离效果欠佳。本文以典型糖皮质激素为模型药物，优化色谱条件，实现多组分杂质的基线分离，为糖皮质激素类原料药的杂质谱分析提供标准化方案。

1、实验设计与色谱条件优化

在实验设计期间，分离并定量糖皮质激素原料药中的有关物质，合成中间体、降解产物、异构体，确保主峰与杂质峰的良好分离、高灵敏度，满足低浓度杂质检测，方法耐用性。

（1）色谱条件初选。色谱柱反相 C18 柱， 250mmX4.6mm ， 5μm_⨀ 。流动相包括A 相：乙腈或甲醇。B 相为缓冲液， 10mM 磷酸二氢钾，pH 2.5-3.0，或 0.1% 甲酸水溶液。初始乙腈- 水30:70，逐步升至乙腈- 水60:40，分离极性差异较大的杂质。流速 1.0mL/min ，柱温 =30-40% ，升高温度可改善峰形，缩短分析时间；检测波长 240-250nm ，根据紫外扫描确定最大吸收波长。进样量 10-20μL ，样品浓度约 1mg/mL ，溶剂为流动相或乙腈/ 水混合液。

（2）优化策略。调整流动相，当分离度不足，调整乙腈比例，改用甲醇，洗脱能力较弱，可能延长保留时间，调节 pH ，改善离子化状态，减少拖尾。针对复杂杂质，设置多步梯度， 0-15min ：乙腈 30%⟶50% ；15-25min ：乙腈 50%⟶60% 。柱温试验测试 25^∘C 、 30% 、35℃对分离的影响。使用色谱柱替代，假如C18 柱效果不佳，可以应用苯基柱或C8 柱。

（3）关键验证参数。理论塔板数主峰 ⩾2000 、拖尾因子、分离度≥ 1.5，空白溶剂无干扰，强制降解试验酸、碱、氧化、光照验证杂质分离。灵敏度，定量限 LOQ⩽0.05% 、检测限 LOD⩽0.015% ，杂质浓度在0.05%-1.0% 内线性良好， R²⩾0.999^[1] 。

在样品处理期间，原料药溶解时避免使用强酸 / 碱，实施流动相或乙腈 - 水。样品溶液需要避光、低温保存，防止降解。使用后以高比例水 -有机相冲洗，避免缓冲盐析出。

2、方法学验证

2.1 专属性验证

专属性是方法学验证的核心内容，需证明方法能够有效区分目标化合物与可能存在的杂质、降解产物及辅料的干扰。具体实验设计包括以下方面：

（1）空白辅料干扰试验。配制不含主成分的空白辅料溶液进样，确认色谱图中主峰位置无干扰峰出现。

（2）强制降解试验。对原料药进行酸水解、碱水解、氧化、高温（ 60% ）、光照等强制降解处理，观察降解产物与主峰的分离度。已知杂质定位，配制各已知杂质对照品溶液，确认其在色谱系统中的保留时间和分离情况；

（3）系统适用性试验。依照理论塔板数、拖尾因子等参数验证色谱系统的分离效能。需要特别注意糖皮质激素类化合物易形成同分异构体，结合实际情况优化流动相组成和柱温，确保分离。

2.2 线性与范围验证

线性范围应覆盖定量限至 120% 的样品浓度，一般选择 5-7 个浓度点进行验证。 配制系列浓度对照品溶液，比如 50% 、 80% 、 100% 、 120% 、150% ，每个浓度平行3 份。以峰面积对浓度进行线性回归，相关系数r 应≥ 0.999，计算 y 轴截距的显著性， ⩽2% 主成分响应值，残差分析应符合正态分布。范围验证需覆盖检测限到定量限的线性关系，同时确认方法在质量标准规定浓度的 ±20% 范围内保持线性。对于糖皮质激素类化合物，需特别注意其在有机溶剂中的溶解稳定性。

2.3 准确度验证

采用加样回收试验验证方法准确度，可以设计三个浓度水平 80% 、100% 、 120% ，每个水平配制3 份样品，加入已知量的主成分和杂质对照品，按样品处理方法制备后进样，计算回收率，相对标准偏差 RSD⩽2.0% ，考察基质效应，特别是原料药中可能存在的辅料对回收率的影响。对于极性较大的糖皮质激素降解产物，需优化提取溶剂比例确保完全提取。

2.4 精密度验证

精密度验证包括重复性、中间精密度和重现性三个层次。重复性：同一分析人员在相同条件下连续进样6 次，计算 RSD⩽1.0% 。中间精密度：不同日期、不同仪器、不同分析人员测定结果的 RSD⩽2.0% 。重现性：不同实验室间验证时 RSD⩽2.5% 。需特别注意糖皮质激素类化合物在溶液中的稳定性。验证时规定样品溶液的保存条件，4℃避光保存不超过 24

小时。

2.5 检测限与定量限及溶液稳定性

检测限采用信噪比法或者标准偏差法确定，通常可达主成分浓度的0.01%-0.05%。定量限信噪比 S/N⩾10 ，需要验证 LOQ 水平的准确度和精密度。对于光敏性强的糖皮质激素，在避光条件下进行低浓度溶液的稳定性研究。有效的考察各溶液在不同条件下的稳定性。对照品溶液室温和冷藏条件下24 小时稳定性。供试品溶液验证0、4、8、12、24 小时的变化。流动相稳定性考察 pH 值变化对保留时间的影响。针对易氧化的糖皮质激素，在溶液中添加抗氧化剂 [2]。通过有目的地改变色谱条件，评估方法的稳健性，检测波长偏移，每个参数改变后需验证系统适用性指标，特别是对极性相近的杂质对的分离度影响，采用实验设计方法进行多因素分析。

3、实际样品分析与杂质溯源

3.1 样品前处理与系统适应性

原料药样品需用甲醇 - 水超声溶解 30% ， 15min ，经 0.22μm 聚四氟乙烯滤膜过滤。验证提取效率，加标回收率 98-102% 和稳定性，室温放置 6h 无降解。系统适用性试验要求理论塔板数＞ 5000，拖尾因子 <1.5 ，重复性 RSD⩽1.0% 。采用主检测波长、辅助波长 220nm ，提高低吸收杂质的检出率，建立杂质谱比对数据库，包含合成中间体、降解产物的保留时间特征。

3.2 杂质检测与峰归属策略

实际检测中重点关注三类杂质，工艺相关杂质、降解杂质及遗传毒性杂质。采用杂质追踪法时，需要通过以下步骤确认。一是强制降解实验。酸、碱、氧化、光照、高温 60% 处理样品，观察新产生杂质。二是 LC-MS/MS联用，采用 ESI+ 模式，对 m/z300-600 范围内的特征碎片分析。三是二维色谱技术。使用不同选择性色谱柱验证杂质共流出情况。四是核磁辅助：对富集后的杂质进行 1H NMR 分析[3]。某泼尼松龙原料药中检出 0.15% 未知杂质，溯源过程LC-MS 显示 [M+H]+m/z 403.2，高分辨质谱确定分子式C21H28O6。对比工艺路线，发现 C11 位羟基化中间体残留，反应釜残留验证，检测到未完全清除的氧化催化剂 Mn(OAc)2 。优化后处理阶段萃取pH 值，增加反相树脂纯化步骤。结合在线过程分析技术，实现从起始物料到成品的全生命周期质量管理，定期进行方法再验证，对工艺变更或新发现杂质情况。

4、结语：

综上，通过 HPLC 方法开发与验证，成功建立了适用于糖皮质激素类原料药有关物质分析的高效、灵敏、专属性检测体系。该方法通过优化色谱条件和样品前处理流程，实现了对主成分及其复杂杂质谱的高效分离与准确定量，分离度、灵敏度和重复性均满足要求。

参考文献：

[1] 张悦. 李华. HPLC 法测定氢化可的松原料药中有关物质的研究[J].药物分析杂志 , 2022, 42(5): 815-821.

[2]王宁.赵刚.刘梅.高效液相色谱法测定泼尼松龙原料药有关物质[J].中国药房 , 2021, 32(18): 2246-2250.

[3] 陈晨 . 孙强 . 基于 HPLC 技术的地塞米松原料药有关物质检测方法研究 [J]. 分析测试学报 , 2020, 39(7): 878-883.