一种小鼠外周血中性粒细胞分离方法的优化改良

中性粒细胞属于固有免疫系统的多形核白细胞，其比例占健康成人外周血循环中白细胞总数的 50%-70%^[1] ，是人体外周血中数量最多的粒细胞。近年来，对中性粒细胞在机体感染防御中功能的研究不断深入，而分离提取高纯度的中性粒细胞成为研究工作开展的前提。

目前，文献报道的分离纯化中性粒细胞的方法主要有密度梯度分离法、免疫磁珠分选法、流式细胞分选法等[2-8]，相较而言，密度梯度离心法是一种相对经济、简便的细胞分离提纯方法，在离心过程中通过改变沉降时间、离心力和密度梯度对混合物中的多个成分进行完全分离，大小、密度相同的细胞或颗粒会作为独立的区域沉降[9]。Percoll作为首选的密度梯度介质，通过与生理盐水按所需密度混合，使细胞和细胞颗粒的密度区间内渗透压保持恒定[5，9]。但以往研究中分离的大多是人、大鼠的中性粒细胞，经过以上分离纯化方法可获得较高纯度的中性粒细胞。

本研究拟优化改良小鼠外周血中性粒细胞分离纯化方法，在传统的 Percoll密度梯度离心法基础上，细化离心步骤，改进离心力和离心时间等参数，并进一步评估了使用该方法提取的中性粒细胞的数量和纯度，以期为中性粒细胞生物学特性及其功能分析和临床脏器组织炎性损伤机制研究提供稳定可靠的技术支撑。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠（8周），体重 22～25g 由斯贝福生物技术有限公司提供［SPF级，动物合格证号：SCXK（京）2024⁃0001］，所有动物实验均获得动物管理与使用委员会批准和监督（实验动物伦理号：IACUC-DWZX-2022-878）。

1.1.2 仪器和耗材

小动物智能麻醉机（ZS-MV-IDV，众实迪创）；台式低温冷冻离心机（3K15，Sigma）；台式高速冷冻离心机（3-18R，湖南可成）；流式细胞仪（Guava easyCyteTM6⁃2L，Millipore）；巴斯德玻璃吸管（747720，东莞康润）；无菌硅化离心管（TUB2016，天津灏洋）；Countstar 自动细胞计数仪（IC1000，上海睿钰）。

1.1.3 试剂

异氟烷（R510-22-10，深圳瑞沃德）；CPDA-1抗凝剂（R10216，北 京 雷 根）；Percoll（17089102，cytiva）； 10×HBSS （14185-052，Gibco）；Alexa Fluor 488标 记 抗 小 鼠Ly6G抗 体（127626，Biolegend）；HBSS平衡盐溶液（G4203，索莱宝）；RPMI-1640培养基（R8758，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 Percoll工作液的配制和梯度制备

将Percoll原液平衡至室温后，Percoll原液： 10×HBSS 缓冲液按体积比为9：1配制成Percoll母液，再将母液用HBSS缓冲液配制成2.5mL 78% Percoll、2 mL 66% Percoll和2 mL 54% Percoll的工作液。使用移液器先将 2.5mL 的 78% Percoll工作液置于 15mL 离心管底部，开始沿着管壁缓慢依次叠放2 mL的 66% 工作液和 12mL 的 54% 工作液。

1.2.2 单次密度梯度离心法分离纯化中性粒细胞

小鼠麻醉后眼球取血至 15mL 离心管中，将全血于室温条件下 350×g 离心 20min ，弃血浆，与PBS缓冲液及红细胞沉降液按照1：1：1比例混匀，室温条件下静置 30min ，吸取上清细胞层至 15mL 离心管中。用HBSS缓冲液将分离的白细胞总容量调至 14mL ，室温条件下 230×g 离心细胞悬液 6min ；弃上清，重复此洗涤步骤，将沉淀物重悬于 2mL HBSS缓冲液中。将细胞悬液小心地加在刚刚制备的梯度最上层，室温条件下 1545×g 离心 30min 。使用玻璃吸管小心吸取 78% 和 66% 界面中间一层絮状层转移至 5mL 离心管中， 4^∘C 条件下500×g 离心 ⋅5min ，弃上清，细胞沉淀用RPMI 1640重悬备用。

1.2.3 两步式离心优化改良法分离纯化中性粒细胞

将全血于室温条件下 300×g 离心 8min 。吸取白膜层，加入2倍体积4 ^∘C 预冷的红细胞裂解液，冰上放置 15min ，其间轻微涡旋混匀两次， 4^∘C 条件下 450×g ，离心 10min ，弃上清，HBSS 缓冲液重悬至2 mL体积。改用无菌硅化离心管，将2mL 78% Percoll工作液置于管底，吸取细胞悬液小心叠于工作液上方， 4^∘C 条件下 1800×g 离心 ⋅40min ；使用玻璃吸管吸取 78% Percoll上的环状细胞层并使用HBSS 缓冲液重悬至 2mL 体积，叠至无菌硅化离心管 2mL66% Percoll工作液上方， 4^∘C 条件下 1800×g 离心 40min ；使用玻璃吸管吸取 66% Percoll界面下层絮状层，转移至 5mL 离心管中， 4^∘C 条件下500×g 离心 ⋅5min ，弃上清，细胞沉淀用RPMI 1640重悬备用。

1.2.4 中性粒细胞数量检测

将分离纯化的细胞悬液混匀后取 20μL 使用自动细胞计数仪进行细胞计数。

1.2.5 中性粒细胞纯度检测

取待测细胞悬液 100μL 加入 900μL PBS， 4^∘C 条件下 500×g 离心 10min ，弃上清， 100μL 1%BSA溶液重悬，加入1 μL Ly6G抗体， 4^∘C 条件下避光孵育 15min ，加入 1mL PBS， 4^∘C 条件下 500×g 离心 10min ，弃上清， 500μL PBS重悬后使用流式细胞仪分析细胞纯度。

1.3 统计学分析

所有数据均采用SPSS 25统计软件进行分析，以均数 ± 标准差（ ）表示，两组间比较采用Student's t检验。 P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 细胞数量检测

为获得高纯度和更多数量的小鼠中性粒细胞，在传统单次密度梯度离心法基础上进行优化改良后，细胞计数结果如图1所示，两步式离心优化改良法每次提取的细胞数量可达到（ 7.5±0.1 ） ×10⁷ 个/mL，与单次密度梯度离心法提取数量（ 5.2±0.3）×10⁷ 个/mL相比，分离提取的细胞数量显著增加（ P<0.0001 ， n=15 ）。

图1 中性粒细胞提取数量分析

⋆⋆⋆⋆p<0.0001 ，与单次密度梯度离心法组相比， n=15

2.2 细胞纯度鉴定

为检验优化改良后中性粒细胞的纯度，使用流式细胞仪检测中性粒细胞标志物Ly6G的表达情况，如图2所示，优化改良后提取的中性粒细胞纯度可达（ 92.52±2.07 ） 0% ，较单次密度梯度离心法提取的中性粒细胞纯度（ 64.45±2.24 ） 0% 显著提高。

图2 中性粒细胞提取纯度分析

单次密度梯度离心法细胞纯度检测结果代表性图片；B. 两步式离心优化改良法细胞纯度检测结果代表性图片；C.中性粒细胞纯度检测结果，⋆⋆⋆⋆p<0.0001 ，与单次密度梯度离心法组相比， n=15

3.讨论

中性粒细胞在吞噬作用、脱颗粒、NETs形成和细胞因子分泌等方面展现了卓越的功能，其主导的炎性反应对机体各组织脏器损伤的作用机制研究，对于防治多种疾病导致的炎性损伤具有非常重要的作用[10]。

为此，本研究建立了一种高效的分离纯化小鼠外周血中性粒细胞的方法，并检测了优化改良后提取的中性粒细胞数量和纯度，与传统的一步离心法相比，两步式离心优化改良法提取的细胞纯度更高、数量更多。本研究建立的分离提取方法不仅能获得高纯度且活性良好的中性粒细胞，同时能保持较高的细胞得率，且无需特殊设备支持，为中性粒细胞生物学特性及功能研究提供了稳定可靠的技术支撑。

参考文献

[1]Levy MM，Evans LE，Rhodes A. The surviving Sepsis Campaign Bundle： 2018 update[J].Intensive Care Med，2018，44（6）：925–8.

[2]王芸，李春晓，孙向婉，等.大鼠外周血嗜中性粒细胞分离方法的优化改良[J].中国兽医杂志，2019，55（12）：108-111+153.

[3]李鹏，邢杰.中性粒细胞的分离与纯化[J].医学理论与实 践，2005，18（3）：272-274

[4]Hu Y. Isolation of human and mouse neutrophils ex vivo and in vitro[J].Methods Mol Biol，2012，844：101-113.

[5]杨琳，田蕾，周璇，等.小鼠骨髓中性粒细胞分离纯化及活性检测研究[J].首都医科大学学报，2018，39（05）：699-703.

[6]Wishart AL，Swamydas M，Lionakis MS. Isolation of Mouse Neutrophils[J].Curr Protoc，2023，3（9）：e879.

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[8]邹常春.全血中性粒细胞分离方法的改进研究[J].实验与检验医学，2009，27（04）：337-338+344.

[9]Pertoft H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll[J].J Biochem Biophys Methods，2000，44（1-2）：1-30.

[10]Michailidou D， Johansson L， Kuley R， et al. Immunecomplex-mediated neutrophil activation in patients with polymyalgia rheumatica[J].Rheumatology （Oxford），2023，62（8）：2880-2886.

通讯作者：阎少多