桂中地区AZFb/c区sY1192、sY153位点微缺失对精子质量影响的临床研究分析

【摘要】目的  研究桂中地区男性携带AZFa基因微缺失类型分布情况和特点。方法  将2018年4月-2023年6月本院生殖助孕中心接诊疗的原发性男性不育患者进行Y染色体微缺失检测。结果 共检出2002位患者携带Y染色体微缺失，其中携带sY1192位点缺失患者137例，检出率为6.84%，汉族87例，壮族45例，仅携带sY1192位点缺失患者45例，占32.85%，汉族31例，壮族10例，其他少数民族4例，其中无精症患者19例，少精症患者21例，精子数量正常患者5例，检出32例缺SY1192、SY153位点患者，占23.36%，汉族22例，壮族5例，其他少数民族患者5例，其精液常规检出16例无精症，11例少精症，5例精子浓度正常患者。结论 sY1192、sY153位点缺失在Y染色体AZF微缺失中属于常见现象，sY1192单位点缺失和sY1192复合sY153位点缺失可表现出不同的临床症状，sY1192单位点缺失在不同民族患者中的检出表型占比存在差异，汉族人多表现为无精症，而壮族人以少精症为主。sY1192复合sY153位点缺失汉族临床症状与sY1192单位点缺失相似，但壮族患者检出精子浓度正常患者比例达40%。

【关键词】无精子症；少精子症；AZF；sY1192；民族

Y染色体微缺失是男性不育的重要原因，其将导致男性生精功能障碍。导致Y染色体小片段缺失的因素有药物和辐射等，其中最主要的因素是遗传因素1。有研究表明，男性不育的遗传因素中，排名第一的为Klinefelter综合症，其次为Y染色体微缺失，在Y染色体中存在一个控制精子生成的基因，称为无精子因子（AZF）2。通常将AZF位点分为三个亚区：AZFa、AZFb、AZFc3。目前对AZFb与AZFc重合区域的研究较少，本研究将近年到柳州市妇幼保健院及广州市妇女儿童医疗中小柳州医院的男性不育患者进行回顾性研究，分析不同民族患者存在于AZFb与AZFc重合区域的sY1192、sY153位点缺失对精子质量造成的影响，为临床治疗诊断男性不育患者提供依据。

1 资料与方法

1.11.1 研究对象  选取2018年4月-2023年6月柳州市妇幼保健院及广州市妇女儿童医疗中心柳州医院生殖助孕中心诊断为Y染色体sY1192或sY153位点微缺失患者。该项目经过广州市妇女儿童医疗中心柳州医院伦理委员会审批，伦理批号为：快审-科研-2023-026，所有患者以签署书面知情同意书。

1.2方法

1.2.1 Y染色体微缺失检测  根据 EAA/EMQN 指南，Y染色体AZF区域微缺失检测采用深圳亚能生物技术公司提供的试剂盒，试剂盒位点包含：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY82、sY1064、sY1065、sY88、sY105、sY121、sY1192、sY153、sY160位点（见表1）。EDTA抗凝管静脉抽取2mL外周血，同时设立阳性对照、空白对照以及阴性对照，混匀后取500μl采用厦门至善生物科技股份有限公司提供的磁珠法提取试剂进行DNA提取，用ABI Veriti 96 well扩增仪进行扩增，扩增产物采用2%琼脂糖凝胶进行电泳，采用 imager gel 分子凝胶成像仪进行产物电泳后分析。

1.2.2 精液常规  精液常规采用北昂BEION S3-2精子质量分析仪对患者精液进行分析，采集精液量、精子浓度、总活力进行分析。

2 结果

2.1  Y染色体微缺失检测结果  共进行2002例Y染色体微缺失基因检测，检出

携带sY1192、sY153位点139例，检出率为6.94%。其中汉族80例，壮族40例，侗族7例，苗族5例，瑶族4例，土族、土家族以及水族各1例。仅携带sY1192单位点微缺失患者45例，占32.37%，汉族31例，壮族10例，苗族1例，瑶族2例，水族1例。携带sY1192、sY153位点微缺失患者32例，占23%，其中汉族22例，壮族5例，侗族4例，苗族1例。（见图1）仅携带sY153单位点缺失患者2例，均为汉族 患者。其余复合多位点微缺失患者例60例，其中缺SY254、SY1192、SY153、SY255位点患者47例，缺SY254、SY105、SY1192、SY88、SY84、SY127、SY1065、SY153、SY86、SY160、SY121、SY255、SY134、SY82、SY1064位点患者3例，缺SY254、SY1192、SY127、SY153、SY160、SY121、SY255、SY134位点患者2例，缺SY1192、SY127、SY121、SY134位点患者2例，缺SY254、SY1192、SY153、SY160、SY255位点患者2例，缺SY1192、SY255位点患者1例，缺SY254、SY105、SY1192、SY127、SY153、SY160、SY121、SY255、SY134位点患者1例，缺SY254、SY1192、SY127、SY153、SY121、SY255、SY134位点患者1例，缺SY254、SY1192、SY127、SY153、SY160、SY121、SY134位点患者1例。（见表1）。

2.2 精液常规检测结果  45例sY1192单位点缺失患者中，检出无精症患者19例（精子密度为0·mL－1），占42.22%，其中汉族16例，壮族3例，检出少精症患者21例（0·mL－1<精子密度<15×106·mL－1），占（46.66%），其中汉族11例，壮族6例，瑶族2例，苗族、水族各1例，检出精子密度正常患者5例（精子密度≥15×106·mL－1），其中汉族4例，壮族1例。32例缺SY1192、SY153位点患者精液常规检出16例无精症，其中汉族12例，壮族3例，侗族1例，

11例少精症，其中汉族8例，侗族2例，苗族1例。5例精子浓度正常患者，其中汉族2例，壮族2例，侗族1例。一例汉族患者检出缺SY1192、SY255位点微缺失，患者检出精子浓度正常，其余患者均检测为无精子症患者。

3.讨 论

在男性中，精子发生位点在Y染色体q11区带，被称为“无精子因子”4，AZF区域富含高度相似基因序列，其基因序列结构重复，因此该区域容易发生插入、缺失、倒位、重复和其他基因突变5，而AZFa区域位于Y染色体着丝粒近端，其完全缺失对精子发生的影响最为严重，会引起仅支持细胞综合症（SCOS），临床上大部分患者表现为无精子症6。AZFb区域位于中间段，其缺失与患者精子发生的减数分裂停滞有关，即无法生成任何减数分裂后生殖细胞7，临床上患者也都表现为无精子症。AZF缺失中最常见的类型是AZFc缺失，其位于着丝粒远端，患者可能表现为正常精子症，少精子症，弱精子症和无精子症8。而这三个区域中，因为AZFc区的可变性，该区为最具争议的区9。

AZFc区缺失是10%的无精子症或重度少精症的根本原因，其包含五个多拷贝基因家族，包括DAZ、CDY1、BPY2、GOLGA2LY和CSPG4LY基因，这些基因都在精子发生中发挥作用10，而另一项研究表明在AZFc和AZFd之间存在第四个AZFd区域，微缺失的相对频率明显偏向包括AZFb和AZFd在内的区域，最高频率出现在AZFd区11。而sY1192、sY153位点位于AZFb与AZFc重合部分区域，本研究中，在Y染色体微缺失检测中出现的频率也是最高的也是sY1192、sY153位点，2023年出版的Y染色体微缺失分子诊断的EAA/EMQN最佳实践指南也指出，只有sY1192位点能够区分AZFb完全缺失和部分缺失12。因此，sY1192做为Y染色体微缺失检测的扩展位点，在临床检测工作中至关重要。

目前国内相对AZFb与AZFc重合部分区域研究相对较少，有研究表明AZFc位点的部分缺失与不育相关，但其影响似乎受到种族的影响13，本研究通过对AZFb与AZFc区重合部分中sY1192、sY153位点检出病例分析发现，45例sY1192单位点缺失患者中，检出无精症患者19例，其中汉族16例，壮族3例，检出少精症患者21例，其中汉族11例，壮族6例，瑶族2例，苗族、水族各1例，检出精子密度正常患者5例，其中汉族4例，壮族1例。汉族共计31人携带sY1192单位点缺失，无精症患者占51.61%，少精症患者占35.48%。而壮族共计10人携带sY1192单位点缺失，无精症患者占比30%，少精症患者中壮族发生率为60%，不同民族患者检出表型占比并不相同，汉族人携带sY1192单位点缺失时多表现为无精症，而壮族人以少精症为主。而32例缺SY1192、SY153位点患者中，汉族22例，无精症患者12例（占54.55%），少精症患者8例（占36.36%），精子浓度正常患者2例（占9.09%），与sY1192单位点缺失汉族患者临床表型比例无显著差异，壮族5例患者中，无精症患者3例（占60%），精子浓度正常患者2例（40%），其他少数名族患者无精子症1例（20%），少精子症患者3例（60%），精子浓度正常患者1例（20%）。以上数据表明汉族人依旧多表现为无精症，壮族人除表现为无精症外，正常精子浓度检出率有所升高，其他少数名族患者也以少精症或正常精子浓度为主，这些差异产生的原因可能与不同民族个体间差异相关，这需要进一步的研究加已证实。

其余Y染色体微缺失检测中，除一例缺SY1192、SY255位点患者检出精子浓度正常，其余携带sY1192复合多位点患者均检测为无精子症患者，这与AZF区域缺失对精子发生有很强的有害影响有关，目前的观点是至少三个AZF区的非重叠区域对人类精子发生很重要。AZFa的完整序列包含0.792Mb区域，其中包括两个单拷贝候选基因USP9Y（DFFRY）和DDX3Y（DBY）14，USP9Y基因是编码泛素酶化家族的成员之一，因为该酶可从蛋白质-泛素络合物中去除泛素，所以它参与蛋白质周转，USP9Y也被认为具有C端泛素水解酶的功能，有研究表明了它在精子发生的第一阶段具有重要的功能15。对于AZFa区域部分缺失患者，一个或两个Y基因的存在可能任然与至少局部生殖细胞的保存相关，当两个生精基因（USP9Y和DBY）同时缺失时，患者临床表型均表现为仅支持细胞综合症（SCO）和无精症16。本研究所使用的sY84、sY86基础位点均位于USP9Y和DBY基因上游，根据缺失的致病机制和目前的经验，一旦检测到sY84、sY86缺失，AZFa区处于完全缺失的概率将非常高，患者也将表现出无精症17。本研究检测到的3例患者携带sY84、sY86位点缺失也均检出临床表型为无精症，结果与指南吻合。AZFb缺失被称为“经典”（即YDNA缺失的长度：6.23Mb），其与患者精子发生的减数分裂停滞（MA）有关，即不存在任何减数分裂后生殖细胞。AZFb缺失包括编码Y染色体的6个基因：EIF1Y、HSFY、PRE、RBMY1、RPS4Y、SMCY（JARID1D/KDM5D）18。本研究所使用的sY127、sY134基础位点位于AZFb区域的正中和远端部分，在大多数情况下，两个标记物的缺失表明AZFb区域的完全缺失17。本研究检出的10例包含sY127、sY134位点缺失患者中，临床表型也均表现为无精子症，与其他地区结果并无差异。AZFc，区则是使用sY254、sY255位点进行标记检测，因为其对DAZ基因具有特异性，缺少这两个标记位点代表缺失了整个AZFc区，而sY1192、sY153位点用于检测AZFb区远端边界以及AZFc区近端边界，因为她们映射到了多个基因组区域17。AZFc区域的缺失表现为各种病理特征，其中46%表现出仅支持细胞综合症，38.2%表现出成熟停滞，15.7%表现出少精子症19。本研究也验证了AZFc区缺失会表现出多样的临床症状，包括严重的少精子症和无精子症20。

综上所诉，sY1192、sY153位点位于AZFb与AZFc重合区域，是Y染色体微缺失检测中的关键位点。本研究表明，sY1192单位点缺失在不同民族患者中的检出表型占比存在差异，汉族人多表现为无精症，而壮族人以少精症为主。而sY1192、sY153位点缺失在不同民族患者中的检出表型占比也存在差异，汉族人依旧多表现为无精症，壮族人除表现为无精症外，正常精子浓度检出率有所升高，其他少数名族患者也以少精症或正常精子浓度为主，这一发现进一步强调了sY1192、sY153位点在临床检测中的重要性。作为Y染色体微缺失检测的扩展位点，sY1192、sY153不仅有助于准确区分AZFb的完全缺失和部分缺失，还为不同民族不育患者的诊断和治疗提供了重要依据。因此，在临床实践中，加强对sY1192、sY153位点的检测和分析，对于指导不育患者的治疗和改善生育结局具有重要意义。

1. O'brien KLf， Varghese AC， Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility： a review. Fertility and sterility 2010;93（1）：1-12

2. Elsaid HOA， Gadkareim T， Abobakr T， et al. Detection of AZF microdeletions and reproductive hormonal profile analysis of infertile sudanese men pursuing assisted reproductive approaches. BMC urology 2021;21（1）：69

3. Vog P， Edelmann A， Kirsch S， et al. Human Y chromosome azoospermia factors （AZF） mapped to different subregions in Yq11. Human molecular genetics 1996;5（7）：933-943

4. Tiepolo L， Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Human genetics 1976;34（119-124

5. Skaletsky H， Kuroda-Kawaguchi T， Minx PJ， et al. The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature 2003;423（6942）：825-837

6. Dicke A-K， Pilatz A， Wyrwoll MJ， et al. DDX3Y is likely the key spermatogenic factor in the AZFa region that contributes to human non-obstructive azoospermia. Communications Biology 2023;6（1）：350

7. Vogt P， Bender U， Deibel B， et al. Human AZFb deletions cause distinct testicular pathologies depending on their extensions in Yq11 and the Y haplogroup： new cases and review of literature. Cell & Bioscience 2021;11（1-13

8. Chen G-X， Sun Y， Yang R， et al. Study on the influence of the sY1192 gene locus in the AZFb/c region on sperm quality and pregnancy outcome. Asian Journal of Andrology 2024;10.4103

9. Navarro-Costa P， Gonçalves J， Plancha CE. The AZFc region of the Y chromosome： at the crossroads between genetic diversity and male infertility. Human reproduction update 2010;16（5）：525-542

10. Nickkholgh B， Korver C， van Daalen S， et al. AZFc deletions do not affect the function of human spermatogonia in vitro. MHR： Basic science of reproductive medicine 2015;21（7）：553-562

11. Kent‐First M， Muallem A， Shultz J， et al. Defining regions of the Y‐chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region （AZFd） by Y‐chromosome microdeletion detection. Molecular Reproduction and Development： Incorporating Gamete Research 1999;53（1）：27-41

12. Krausz C， Navarro‐Costa P， Wilke M， et al. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y‐chromosomal microdeletions： state of the art 2023. Andrology 2024;12（3）：487-504

13. Colaco S， Modi D. Genetics of the human Y chromosome and its association with male infertility. Reproductive biology and endocrinology 2018;16（1-24

14. Rani DS， Rajender S， Pavani K， et al. High frequencies of Non Allelic Homologous Recombination （NAHR） events at the AZF loci and male infertility risk in Indian men. Scientific Reports 2019;9（1）：6276

15. Foresta C， Moro E， Rossi A， et al. Role of the AZFa candidate genes in male infertility. Journal of endocrinological investigation 2000;23（646-651

16. Hopps C， Mielnik A， Goldstein M， et al. Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa， AZFb and AZFc regions. Human reproduction 2003;18（8）：1660-1665

17. Krausz C， Hoefsloot L， Simoni M， et al. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y‐chromosomal microdeletions： state‐of‐the‐art 2013. Andrology 2014;2（1）：5-19

18. Sumner A， Chandley A， Vogt P， et al. The ‘AZF’-function of the human Y chromosome during spermatogenesis. Chromosomes Today： Volume 11 1993;227-239

19. Zhang H， Li H， Ma S， et al. Very severe oligozoospermia with AZFc microdeletion patients may affect intracytoplasmic sperm injection clinical outcomes： A propensity score matching analysis. Reproductive Medicine and Biology 2024;23（1）：e12596

20. Yuen W， Golin AP， Flannigan R， et al. Histology and sperm retrieval among men with Y chromosome microdeletions. Translational andrology and urology 2021;10（3）：1442

*通信作者：钟青燕

基金项目：广西壮族自治区卫生健康委员会科研课题（Z-B20232025）广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题（Z20211191）