血液中抗抑郁新药立阿芬辛的LC-MS/MS检测方法

抑郁症，是当今世界普遍存在的心理精神疾病之一，该病尤其是在当今中国青少年之中占比很高，2020-2022整整3 年的疫情封控，从生理或心理上更是加剧了该病在人群中发生的普遍性[1]。其中轻度抑郁症人群可通过心理疏导、人文关怀等非药物手段治愈，而中重度抑郁症人群的治疗则主要依赖抗抑郁药物。目前市面上常见抗抑郁药品种较多，比如：阿米替林、多塞平、米氮平、文拉法辛、美利曲辛、舍曲林、西酞普兰、帕罗西汀、氟西汀、曲唑酮等。这些常见抗抑郁药对治疗抑郁症均有良好的效果。但总会出现一些个例，在某种特定情况下，常见抑郁药对于一些重度抑郁症患者的治疗效果十分有限，即使短期之内能控制住病情，大多数情况下一段时间以后抑郁症患者病情可能复发甚至加重。让人感到欣尉的是，药物研发工作者一直在默默的研发全新的靶向抗抑郁药物，针对病灶病理研发特异性药物，进行精准治疗。终于一款治疗难治性抑郁症新药立阿芬辛（Liafensine）即将上市，目前正在国际医疗机构多中心进行临床试验，让我们期待它早日成功在国内上市，为难治性抑郁症患者带来新生。该新药结构式和基本信息分别见图1 和表1[2]。

任何一种药物在人体内的作用机制是十分复杂的，一种新药的成功上市只能证明前期药物研究、临床试验的安全性，随着其上市后用药群体的扩大及监管的缺失，其对人体长期潜在的危害因素势必将累积放大，有必要对这一担忧提前准备，建立血液中抗抑郁新药立阿芬辛的LC-MS/MS 检测方法，为法医毒物检测及医学研究工作者决策者提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent1100 液相色谱仪（Agilent，美国），AB3200 三重四级杆串联质谱仪（SCIEX，美国）。电子天平 (d⩽0.lmg) ），超纯水机，旋片式真空泵，涡旋仪，超声仪，离心机，氮吹仪等[3]。

对照品：立阿芬辛（索元生物医药，杭州），SKF525A 内标（斯坦福化学公司，美国），纯度均大于 99% 。试剂：甲醇、乙腈（均为色谱纯），无水乙醚、甲酸、乙酸铵、十水合四硼酸钠（均为分析纯），以上试剂均购自国药集团[4]。

1.2 仪器测定条件

液相色谱条件：色谱柱为岛津 Shim-pack XR-ODS ⟨100mm×3.0mm×2.6μm⟩ ，接C18 保护柱；流动相 A为水 800mL、乙腈 42mL、88%甲酸 477μL、乙酸铵 129.7mg 的缓冲溶液；流动相 B 为甲醇 800mL、水 42mL、88%甲酸 477μL、乙酸铵 129.7mg 的缓冲溶液；流速为 300μL/min，柱温为室温，进样量为10μL。流动相梯度洗脱程序见表 2^[5] 。

质谱条件：碰撞气（CAD）：5、气帘气（CUR）：20、离子喷射电压（IS）：5500、雾化温度（TEM）：500、雾化气（GS1）：50、辅助气（GS2）：50[6]。筛选分析药物母离子、子离子，母离子为 367.1，其中324.2 的子离子丰度仅次于母离子，将其作为定量离子对最理想，另选取336.2 的子离子与其共同组成2 对定性离子对。立阿芬辛母离子、子离子丰度见图 2。优化最佳去簇电压（DP）和碰撞能量（CE），电喷雾电离-正离子模式（ESI﹢），MRM 多反应监测，离子驻留时间为5ms。目标物质谱参数见表3[7]。

1.3 标准溶液的配制

取立阿芬辛对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并配制质量浓度为0.02、0.06、0.2、0.6、1、2μg/mL 的系列立阿芬辛对照品溶液（各系列均加入等量内标溶液），在正离子模式（ESI﹢）下检测[8]。

1.4 样品前处理

取待测血液 1.0mL，加入 10μL SKF525A（ ）内标溶液，加入 2mL pH9.2 硼酸缓冲液后用 3.5mL乙醚提取，混旋，离心，上清液于60℃水浴中挥干，残余物中加入 300μL 流动相A 复溶，进LC-MS/MS 分析。立阿芬辛及内标总离子流见图3[9]。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

立阿芬辛属于极性化合物，易溶于DMSO、甲醇、乙醇、丙酮等极性有机溶剂。目前，国内外对于极性化合物的提取广泛采用乙酸乙酯作为提取溶剂，但乙酸乙酯的沸点较高，达77.2℃，对沸点低的毒物提取不利。司法部标准SF/T 0175-2024《血液和尿液中238 种毒(药)物的液相色谱-质谱检验方法》采用乙醚作为提取溶剂，乙醚极性大小中等，沸点低，仅为34.6℃。可作为大多数毒物的提取溶剂，所以本人也选择乙醚作为立阿芬辛的提取溶剂。

血液中毒物的样品前处理方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）、顶空气相法（HS-GC）、QuEChERS 法等。蛋白沉淀法操作简单、成本低，适用于部分水溶性药物及代谢物，比如乙基葡萄糖醛酸苷（EtG），该法干扰物较多，需结合净化步骤。固相萃取法纯度高、可自动化，适用毒物广泛且灵敏度高，比如农药、毒品等，该法需优化洗脱条件且成本较高。顶空气相法操作简单、无需复杂前处理，适用于挥发性毒物，比如乙醇、一氧化二氮、氰化物等。QuEChERS 法适用于高通量、复杂基质样品的前处理，广泛适用于农药、兽药残留等。对于血液中立阿芬辛的提取，本人最终选择液液萃取法。立阿芬辛属于碱性药物，待测样品中加入pH9.2 硼酸缓冲液后，可有助于血液中目标物的有效溶出，避免待测血液与有机溶剂直接接触而沉淀，液液萃取使得目标物从水相转移进入有机相，便于目标物的富集及后续复溶上机分析。内标的添加是表征样品前处理后目标物是否被有效提取出来的关键。

2.2 液相色谱条件的优化

由于受液相硬件条件所限，本所为Agilent1100 型普通液相，流动相流速不能达到0.5mL/min，考虑到柱压的限制，选择 100mm 长的液相色谱柱，选用岛津 Shim-pack XR-ODS (100mm×3.0mm×2.6μm) ）型号色谱柱可满足本研究的需要。

比较甲醇-水、乙腈-水作为流动相的效果，并加入低浓度的甲酸和乙酸铵缓冲盐进行优化。结果显示立阿芬辛在甲醇-水系统中的离子化效果最好，同时又对流动相梯度洗脱程序等条件进行优化，最终立阿芬辛的色谱保留时间适当，最高柱压约为 3500psi，适合在普通液相色谱上运行，色谱峰形良好，能与杂质峰达到基线分离。

2.3 质谱条件的优化

由于立阿芬辛是极性化合物，可以在电喷雾正离子（ESI+）模式下电离，在该模式下对质谱条件进行优化。Q1 扫描时可见[M+H]+峰，即质荷比为367.1 的母离子，MS2 扫描时对准母离子峰进行子离子扫描，得到碎片离子信息，丰度显著子离子有 5 个，分别为：324.2、336.2、239.2、225.1、184.3，其中 324.2 的子离子丰度仅次于母离子，将其作为定量离子对最理想，另选取 336.2 的子离子与其共同组成2 对定性离子对。立阿芬辛184.3 的子离子丰度较低，且昂丹司琼也存在该子离子，故不选 184.3 的子离子与 324.2 的子离子组队。然后再MRM 扫描对去簇电压、碰撞能量等参数进行优化，使得所选择的两对定性子离子对的信号达到最佳，以保证其具备较好的定量重复性。

2.4 线性范围、检出限和定量限

依次取 1mL 空白血液分别添加系列浓度的立阿芬辛标准溶液，按1.3 法提取，然后进行LC-MS/MS 分析[10]。记录信噪比（S/N）为3 和10 时的浓度为检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果表明，立阿芬辛的LOD 为5ng/mL，LOQ 为 10ng/mL[11]。

配制系列浓度的立阿芬辛标准溶液，以目标物与内标物色谱峰面积之比（y）对进样浓度（x，μg/mL）进行回归计算考察立阿芬辛的线性关系[12]，结果表明在所实验的浓度范围内均成良好的线性线性关系。线性回归方程及相关系数（r2）见表4[13]。

2.5 精密度与回收率

取 3 份空白血液，每份各 1mL，分别添加立阿芬辛标准溶液，使其分别位于低浓度（ 0.02μg/mL ）、中浓度（0.2μg/mL）和高浓度（2μg/mL）3 个浓度水平，按 1.3 法提取，然后进行 LC-MS/MS 分析[14]。每个水平平行分析6 次，日内和日间测试，计算精密度与回收率，结果每个水平的RSD 均小于 5% ，回收率在 85～110% 。精密度与回收率数据见表5[15]。

2.6 案例资料

2023 年9 月5 日，市公安局朝阳分局刑侦支队接警在朝阳某小区发现一名30 岁年轻男子死亡，在其住处发现两瓶临床试验药瓶A 瓶和B 瓶，瓶身标注DB104-01 Liafensine（后经查阅资料确认为立阿芬辛），警方遂怀疑其服用该药导致死亡，本所病理科同事抽取死者心血和药瓶一同来毒物科送检，发现死者心血中的药物与药瓶标注非同种药物，死者心血中检出的药物及含量为0.14 微克昂丹司琼每毫升心血，未检出立阿芬辛。这是一款用于预防癌症患者在接受放疗或化疗时的恶心呕吐反应的药物，说明死者并非死于服用抗抑郁新药立阿芬辛。但是立阿芬辛该药可能对人体健康具有潜在的副作用，本文的研究给其他法医毒物分析工作者在遇到需要检测血液中立阿芬辛问题的时候提供了借鉴和参考。

3 结论

立阿芬辛是一种还处于临床试验阶段的抗抑郁新药，目前还未有因临床试验而导致中毒死亡的案例，通过文献检索也未找到在生物检材中该药物的检测方法，本研究所建立的方法提供了法医毒物领域血液中有关该药物检测方法的参考。该方法可应用于治疗药物监测（TDM），实时调整立阿芬辛的临床给药剂量；也可应用于药代动力学研究，分析立阿芬辛在血液中的吸收、分布和代谢动力学；还可应用于毒理学研究，检测立阿芬辛过量或不良反应（中毒乃至致死）时的血药浓度。该方法简便、快速、特异性强、灵敏度高、在低粘稠度新鲜血液基质中精密度和精确度也高，可满足临床毒物和法医毒物检测的需要[16]。本方法仅对血液中该药物的检测方法做了简单研究，对该药物在其它基质、基质效应及体内代谢物未做深入研究，关于该药物的后续研究可以着重从以上几点入手。

参考文献

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作者简介：王俊（1986-），男，汉族，湖北荆州人，法医师，本科学历，研究方向为法医毒物分析。