脯氨酸对大牡蛎弧菌生长及抗氧化能力的影响

摘要：为探究不同氨基酸作为碳源对大牡蛎弧菌生长的影响，本实验在M9培养基中分别添加各氨基酸培养大牡蛎弧菌S2，实验结果表明脯氨酸作为唯一碳源时大牡蛎弧菌S2的生长情况最好。后续研究了脯氨酸对大牡蛎弧菌抗氧化能力的影响，发现在过氧化氢浓度为0.4 mM时，脯氨酸对大牡蛎弧菌S2的抗氧化能力有显著的促进作用。本实验表明，脯氨酸不仅是大牡蛎弧菌重要的碳源，而且可以增强大牡蛎弧菌的抗氧化能力。

关键词：大牡蛎弧菌；脯氨酸；生长；抗氧化

大牡蛎弧菌（Vibrio crassostreae）是一种革兰氏阴性海洋细菌，有研究表明大牡蛎弧菌可以感染牡蛎[1]和扇贝[2]，引起宿主高死亡率，对水产养殖产业有严重危害。在最近的研究中，患病的幼鱼中也分离出大牡蛎弧菌，进一步证明了该种弧菌的危害性[3]。目前关于大牡蛎弧菌的研究较少，因此需要进一步研究该弧菌的特性，从而为防治其引起的疾病提供帮助。氨基酸在细菌的生理活动中起着重要作用，其中多种氨基酸被认为是细菌生长的重要碳源和氮源[4]。亦有研究表明，脯氨酸与细菌生物合成和氧化应激抗性密切相关[5]。通过探究氨基酸在弧菌生长和氧化应激中的作用，可以为水产养殖中细菌性疾病的防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株与材料

大牡蛎弧菌（V. crassostreae）S2分离于患病的菲律宾蛤仔；氨基酸（上海，生工有限公司）；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（北京，Solarbio）；磷酸铁、氯化钙、硫酸镁（上海，阿拉丁生化科技股份有限公司）；3%过氧化氢（福建，析标生物科技有限公司）；恒温培养箱（上海，舜宇恒平科学仪器有限公司）；超纯水仪（北京，普析通用仪器有限责任公司）；酶标仪（杭州，奥盛仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 单一氨基酸碳源培养大牡蛎弧菌

按照Zhang等的方法配置M9培养基错误！未找到引用源。，氨基酸按照（表1）中浓度进行配制错误！未找到引用源。，0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，保存于4 ℃冰箱备用。将大牡蛎弧菌S2以1%的比例接种至2216E培养基中28 ℃过夜培养，然后将培养好的菌液5000 g离心3 min，用无菌M9基础培养基重悬细菌沉淀。在96孔板中，分别给20个孔添加20 μL重悬后的S2菌液和180 μL M9培养基，然后每孔添加不同的氨基酸，同时设置一个不加氨基酸的样品作为对照，每种氨基酸重复3组。28 ℃培养箱中孵育培养3天，每天监测细菌培养液的OD600。

1.2.2 脯氨酸对大牡蛎弧菌抗氧化能力的影响

根据前期的预实验，设置0.6mM、0.4mM、0.2mM、0mM四种过氧化氢浓度，在每个装有5 mL 2216E培养基的试管中添加1024 μg/mL的脯氨酸培养S2，同时设置一组不加脯氨酸的对照，观察脯氨酸能否影响S2抗氧化的能力。试管置于28℃培养，每12 h使用酶标仪（杭州奥盛）测量各个试管中菌液的OD600。

2 实验结果

2.1 大牡蛎弧菌S2对氨基酸的利用

培养至24 h时，分别添加丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和苏氨酸为碳源的培养液OD600均可达到0.2以上，分别添加精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸的OD600均处于0.1和0.2之间，而分别添加组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和对照组的OD600均低于0.1。培养至48 h时，仅有谷氨酸组的OD600增长到0.2以上，赖氨酸组增长到0.1以上。培养至72 h时，仅有脯氨酸组的OD600增长到0.3。综上所述，以单一氨基酸作为碳源的情况下，脯氨酸作为唯一碳源时S2的生长情况明显最好。

2.2 脯氨酸影响大牡蛎弧菌S2抗氧化能力

培养液中分别添加0.2 mM双氧水，对S2的生长无影响，添加0.4 mM双氧水显著抑制S2生长，但是添加0.6 mM双氧水可完全抑制S2的生长。在添加双氧水的同时添加脯氨酸，在添加0.6 mM过氧化氢的情况下，脯氨酸对S2的抗氧化能力无增加。在0.4 mM的过氧化氢浓度下，添加了脯氨酸的S2生长显著高于不添加脯氨酸组的生长。

3 讨论

20种氨基酸中，脯氨酸对大牡蛎弧菌S2的促进作用最为显著，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸也对S2的生长有一定的促进作用。有研究表明，脯氨酸代谢不仅可以提供能量，还可以增强大肠杆菌的氧化应激抗性[5]。在本研究中，脯氨酸是大牡蛎弧菌重要的碳源，并且对大牡蛎弧菌的抗氧化能力也有显著提升。在双氧水浓度为0.4 mM时，脯氨酸可以帮助S2抵御氧化压力，但在0.6 mM的双氧水浓度下，添加了脯氨酸的S2生长被抑制，这表明脯氨酸只能在特定氧化压力下提升S2的抗氧化能力。以脯氨酸代谢为靶标，减少大牡蛎弧菌可获得的脯氨酸，可能会降低大牡蛎弧菌的抗氧化能力，从而有助于防治其引起的疾病。本实验只探讨了脯氨酸对大牡蛎弧菌抗氧化能力的影响，具体的影响机制还需要进一步研究。

参考文献：

[1] Travers M A， Miller K B， Roque A， et al. Bacterial diseases in marine bivalves[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2015， 131： 11-31.

[2] Bruto M， James A， Petton B， et al. Vibrio crassostreae， a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition[J]. The ISME Journal， 2017， 11（4）： 1043-1052.

[3] Tomasoni M， Esposito G， Mugetti D， et al. The Isolation of Vibrio crassostreae and V. cyclitrophicus in Lesser-Spotted Dogfish （Scyliorhinus canicula） Juveniles Reared in a Public Aquarium[J]. Journal of Marine Science and Engineering， 2022， 10（1）： 114.

[4] Nagata K， Nagata Y， Sato T， et al. L-Serine， D-and L-proline and alanine as respiratory substrates of Helicobacter pylori： correlation between in vitro and in vivo amino acid levels[J]. Microbiology， 2003， 149（8）： 2023-2030.

[5] Zhang L， Alfano J R， Becker D F. Proline metabolism increases katG expression and oxidative stress resistance in Escherichia coli[J]. Journal of Bacteriology， 2015， 197（3）： 431-440.

[6] Zhang W， Yamasaki R， Wood T K. Interkingdom Signal Indole Inhibits Pseudomonas aeruginosa Persister Cell Waking[J]. Cold Spring Harbor Laboratory， 2019（6）.

[7] Setlow J， Rodriguez R L， Tait R C. Recombinant DNA Techniques： An Introduction[J]. BioScience， 1984， 34（10）.

[8] Szabados L， Savouré A. Proline： a multifunctional amino acid[J]. Trends in plant science， 2010， 15（2）： 89-97.