四川省甘孜州康定市兔肠道枯草芽孢杆菌的分离鉴定

摘要：兔肠道菌内有着丰富的纤维素菌群，兔做为常见动物，以兔为研究对象分离出所需菌种，易取得的同时将会节约成本。试验目的主要从家兔中分离出纤维素菌群中的枯草芽孢杆菌，以家兔肠道内容物以及粪便为分离源，结合形态学与生理生化[]鉴定，并通过16S rRNA基因测序进行菌株判定。其应用广泛，对人体和动物的生长发育起着良好的效果，可以用于饲料的研究，环境的保护。

关键词：枯草芽孢杆菌；分离鉴定；药敏试验

Abstract： Rabbit intestinal bacteria are rich in cellulolytic flora， rabbit as a common animal， rabbit as a research object to isolate the required strains of bacteria， easy to obtain at the same time will save the cost. The purpose of the experiment is to isolate Bacillus subtilis from rabbits in the cellulolytic flora， using rabbit intestinal contents as well as feces as the source of isolation， combined with morphological and physiological and biochemical identification， and through 16S rRNA gene sequencing to determine the strain. It has a wide range of applications， plays a good effect on human and animal growth and development， and can be used for feed research and environmental protection.

枯草芽孢杆菌在动物的肠道可以通过刺激肠道各种消化酶，在消化酶的作用下可以有效吸收饲料中营养物质产生，提高饲料转化率，同时枯草芽孢杆菌可以产生有机酸，促进体内维生素和矿物质的吸收[1]。枯草芽孢杆菌进入消化道后，可诱导产生肠道免疫屏障，激活抗体，激活体液免疫，并通过淋巴细胞再循环活化全身免疫系统，增强机体免疫功能[2]。将枯草芽孢杆菌在肥育猪生产中应用，可提高屠宰性能，改善肉品质，降低粪便中氨气含量，减轻环境污染[3]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品的采集

本试验采集四川省甘孜州康定市内若干兔的新鲜粪便样本以及肠道内容物。

11.1.11.1.2主要试剂和仪器

超净工作台、高压灭菌锅、生化培养箱、高速离心机、涡旋振荡仪、PCR仪、水平电泳仪等实验仪器由四川民族学院农学实验楼提供。

革兰氏染色试剂盒、V-P试剂购自广东环凯微生物科技公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；牛肉膏蛋白胨培养基（LB）、普通营养肉汤（NB）培养基、卢戈碘液（标准碘液）、硝酸盐还原试剂（亚硝酸盐试剂）、羧甲基纤维素钠培养基、枯草芽孢杆菌套装生化鉴定管，购自山东拓普生物工程有限公司，16S rDNA细菌菌种鉴定PCR试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

11.11.2方法

11.11.2.1枯草芽孢杆菌的分离

取家兔肠道内容物以及粪便5g，放置到有45g蒸馏水的三角瓶中，震荡混匀后，加热煮沸15min，待冷却后取上清液配置为1%的悬浊液，接种于营养肉汤培养基48h。将增殖培养后的家兔盲肠内容物混合菌液做准确十倍稀释，各吸取稀释度为10-5、10-6、10-7倍的肉汤0.1mL分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基（LB），每个稀释度做两个平板，37℃倒置培养。

1.2.2枯草芽孢杆菌初步鉴定和分离提纯

挑取分离平板上的单个、无规则、隆起、表面粗糙有褶皱的菌落进行形态学鉴定（革兰氏染色），将疑似菌株接种于选择培养基（羧甲基纤维素钠培养基）上划线分离培养，加入刚果红试剂，筛选出有纤维素分解能力的菌株。再将芽孢杆菌的单菌落接种于营养肉汤培养基，选取生长状况最好的菌株。

1.2.3枯草芽孢杆菌的生化鉴定

枯草芽孢杆菌套装生化鉴定管内对纯化菌株进行生理生化鉴定，主要包括：吲哚试验 ，VP试验，甘露醇，明胶液化，7％氯化钠生长，PH5.7生长，硝酸盐还原，淀粉水解，柠檬酸盐，葡萄糖产酸，丙酸盐，D－木糖、L－阿拉伯糖、甘露醇发酵。

1.2.4PCR检测

细菌基因组的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明进行，采取通用引物pcr扩增引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）来扩增16SrRNA基因序列，根据16SrDNA细菌菌种鉴定PCR试剂盒说明在PCR管中配制PCR反应溶液，并设定反应程序：预变性94℃5min；变性94℃30sec、退火55℃30sec、30延伸72℃1min30sec，共30个循环；终延伸72℃10min。使用琼脂糖凝胶电泳方法对PCR扩增产物进行分析。结果说明部分样本成功扩增出了大约1500个碱基对的片段，其大小与预期目的片段相匹配。基于这一结果，这些样本被初步确认为枯草芽孢杆菌（详细结果见图1）

11.11.21.2.11.2.21.2.31.2.41.2.5序列分析

为进一步确认枯草芽孢杆菌种类，将所提取的DNA样本送往成都擎科梓熙生物技术有限公司进行双向DNA测序，测序完成后。经过NCBI BLAST在线比对分析，有两份样本与枯草芽孢杆菌的同源性达到99%。

2讨论和分析

根据我国农业农村部对十三届全国人大二次会议第1713号建议的答复中可以得知枯草芽胞杆菌列入到我国《饲料添加剂品种目录》，它具有促进动物营养成分消化吸收、抑菌、调控肠道菌群和提高动物免疫力等作用，其具有的产生孢子的能力，让其具有很强的抗逆性，对高温、强酸、胆盐的耐受性强，因此，枯草芽孢杆菌可作为益生菌饲料添加剂应用于畜禽生产[4]，被认为是饲添抗生素的最佳替代品之一。

国内将枯草芽孢杆菌与中药成分进行联合使用制备成微生物制剂，经过犊牛体内实验证明，对引起犊牛腹泻抗病原微生物有抑制作用，并且在提高犊牛免疫力，减少应激，提高犊牛抗氧化能力等方面有正向作用[5]。还有研究通过发酵培养枯草芽孢杆菌L2株，菌液经离心过滤后获得的次级代谢产物可通过抑 制病毒吸附、侵入和复制多个阶段发挥抗病毒活性，在体内外均可抑制伪狂犬病毒（PRV）感染[6]。

在国外的研究报告中通过对育肥期高危牛饲粮中添加枯草芽孢杆菌PB6可以有效的降低因各种诱发因素导致的消化系统紊乱和牛呼吸系统疾病相关的发病率和死亡率，改善高危牛的生产性能和健康[7]。还有研究表明通过在奶牛日粮中添加枯 草芽孢可以奶牛瘤胃液中的异丁酸水平增加，降低血浆非酯化脂肪酸浓度，提高饲料的的能量利用率，改变奶牛的能量代谢[8]。经枯草芽孢杆菌等益生菌的饲料发酵后能够提高营养物质含量、降低其中的不良因子[9，10]

3小结

本文章针对四川省甘孜州康定市地区兔肠道枯草芽孢杆菌进行了分离鉴定。试验结果成功得到两株同源性达到99%的枯草芽孢杆菌。本试验的成果为后续甘孜州康定市兔枯草芽孢杆菌的研究提供了数据支撑。

参考文献

[1]李剑. 日粮中添加枯草芽孢杆菌对猪生产性能的影响[J]. 中国动物保健， 2024， 26（07）：69-70.

[2]付雪， 张启航， 刘周靓， 等. 枯草芽孢杆菌在动物生产中的应用与作用机制[J]. 饲料研究， 2024， 47（08）：150-155.

[3]冯丽丽. 枯草芽孢杆菌在养殖生产中的应用及对动物肠道健康的影响研究进展[J/OL]. 河南农业科学， 2024：1-12.

[4]张关锋， 杨泰， 宋先凡， 等. 枯草芽孢杆菌的生理功能及其在畜禽生产中的应用[J]. 中国畜牧兽医， 2024， 51（04）：1511-1519.

[5]王蓝卓. 枯草芽孢杆菌微生态制剂的制备及其对犊牛腹泻的预防作用[D]. 吉林大学， 2024.

[6]王晓丽. 枯草芽孢杆菌代谢产物抗病毒活性物质的筛选鉴定及作用机制研究[D]. 山东农业大学， 2024.

[7]Smock T M， Samuelson K L， Wells J E， et al. Effects of Bacillus subtilis PB6 and/or chromium propionate supplementation on serum chemistry， complete blood count， and fecal Salmonella spp. count in high-risk cattle during the feedlot receiving and finishing periods[J]. Translational Animal Science， 2020， 4（3）： txaa164.

[8]Kawauchi D， Angthong W， Keaokliang O， et al. Effect of feeding B acillus subtilis on rumen fermentation， blood metabolites， nutrient digestibility， and energy and nitrogen balances in non‐lactating crossbred cows[J]. Animal Science Journal， 2021， 92（1）： e13531.

[9]Zhang Y， Ishikawa M， Koshio S， et al. Optimization of soybean meal fermentation for aqua-feed with Bacillus subtilis natto using the response surface methodology[J]. Fermentation， 2021， 7（4）： 306.

[10]Wang Y， Sun H， Liu X. A novel fermented rapeseed meal， inoculated with selected protease-assisting screened B. Subtilis YY-4 and L. Plantarum 6026， showed high availability and strong antioxidant and immunomodulation potential capacity[J]. Foods， 2022， 11（14）： 2118.

基金资助：四川民族学院自办科研项目（S202411661060）；四川民族学院自办科研项目（202311661023）

作者简介：徐雨轩（2003─），男，四川省宜宾市人，汉族，本科在读。

* 通信作者：肖启程，男，1993年2月出生，626001，陕西省汉中市人，汉族，硕士研究生，四川民族学院，讲师，主要从事兽医寄生虫病学研究