盔犀鸟 12SrRNA基因序列的测定与分析

摘要：盔犀鸟（Rhinoplax vigil）作为一种珍稀鸟类，其基因序列的研究对于理解其生物学特性、种群遗传结构及进化历史具有重要意义。12S ribosomal RNA （rRNA）基因，因其高度保守性、丰富的变异位点和相对快速的进化速率，被广泛应用于物种鉴定、系统发育分析以及遗传多样性等生物信息学分析。本研究选取盔犀鸟的角质头胄作为样本。采用柱膜法提取样本DNA。使用3对引物扩增12SrRNA基因片段，经拼接后获取完整的12SrRNA基因。对序列的碱基组成及替换进行了分析，探究盔犀鸟12SrRNA基因密码子偏好性，所有密码子的频率在1.1-13.1之间。相对同义密码子使用度在0.32-2.51之间。在遗传距离分析方面，通过与其他15种鸟类的12S rRNA基因序列比较，盔犀鸟与其他15种鸟类的遗传距离处于0.114-0.178，样本平均遗传距离为0.149。其中，盔犀鸟与银颊噪犀鸟和巽他皱盔犀鸟所呈现出的遗传距离最小，亲缘关系较近。盔犀鸟与大溪地矶鹬所呈现出的遗传距离最大，亲缘关系较远。最后，通过构建系统发育树，揭示了盔犀鸟与其他物种之间的进化关系。

通过遗传距离分析和系统发育树构建，揭示了盔犀鸟与其他物种之间的进化关系，为理解其进化历史提供了重要依据。

关键词：盔犀鸟； 12SrRNA；序列测定；生物信息学分析；系统发育树

1.材料和方法

1.1 材料

选用盔犀鸟角质头胄作为材料，取样后保存在1.5 mL离心管中，放置-20 ℃冰箱备用。

1.2 实验仪器及设备

掌上离心机、超高速离心机、梯度PCR仪、恒温混匀器、电泳设备、高精度天平、迷你离心机、超净工作台、凝胶成像系统等。

1.3 试剂

TaKaRa 通用型基因组 DNA 提取试剂盒、Premix TaqTMDNA聚合酶、TSJ001琼脂糖、TanonTM 核酸染料、DL2000 DNA Marker、0.5X TBE

1.4 基因组的提取

DNA试剂盒为TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 （No.9765）试剂盒，提取样品总DNA。

取2-25 mg的动物组织粉末，放入于tube中。

加入180μL Buffer GL、20μLProteinase K、10μLRNase A，置于56℃恒温混匀仪中进行组织裂解，对于可能存在的难裂解组织可适度延长处理时间。在进行恒温水浴过程中可将样品取出，通过振荡、吸打的方式催动裂解。

（3）在形成的裂解液中继续加入Buffer GB和100%乙醇各200 μL ，充分振荡、混匀。

（4）将旋转离心柱放在收集管中，将溶液移动至旋转离心柱中，以12，000 rpm的方式进行2 min离心处理，除去滤液。

（5）将500 μL Buffer WA加入旋转离心柱，将转速设置为12，000 rpm进行离心处理，除去滤液。

（6）将700 μL Buffer WA加入旋转离心柱，将转速设置为12，000 rpm进行离心处理，除去滤液。将此操作再重复一遍，充分离心，得到所需滤液。

（7）将旋转离心柱置于收集管中，将转速设置为12，000 rpm，离心处理2 min。

（8）在新离心管中（容量为1.5 mL）放置旋转离心柱，将50至200 μL灭菌水或Elution Buffer加入旋转离心柱中心位置，在加入之前需要将溶液加热至65 ℃，以提升洗脱效率，加入后在室温环境下保持静止放置5 min。

（9）以12，000 rpm的方式进行2 min离心处理，实现DNA洗脱，将所得到的离下液放于旋转离心柱中心位置，再加入50至200 μL灭菌水或Elution Buffer，室温环境下保持静止放置5 min，以12，000 rpm的方式进行2 min离心处理，实现DNA洗脱。

（11）对基因组中的DNA进行定量。提取得到的基因组DNA可通过电泳或吸光度测定以定量。

1.5 目的基因扩增

此次扩增片段为12SrRNA基因，引物来自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.6 电泳检测

（1）制胶：用高密度天平称量0.75 g琼脂糖，移入锥形瓶内，用量筒量50 ml TBE溶液后倒入锥形瓶（保证琼脂糖凝胶的浓度为1.5%），振荡使其混匀，再使用微波炉进行加热1 min，使其充分溶解。向加热完成溶液中加入5 μL 15-GelRed核酸凝胶染料Ver2再次振荡摇晃，将制备好的溶液倒入制胶容器中，插入梳齿，静置10 min，待其冷却完毕凝固后取出梳齿。

（2）加入DNA：将制备好的胶体放入电泳仪器中（仪器保持关闭），倒入少量TEB溶液，保证TEB溶液刚好没过胶体即可。向胶孔内加入2.5 μL DNA分子量标准 Marker，以便于通过对比估计分子标准量。再依次向胶孔内加入2.5 μL PCR扩增后的DNA。

（3）电泳检测：将电压调至220V进行电泳检测，时间时长为20min。

1.7 12SrRNA基因序列分析

通过测序得到的盔犀鸟12S rRNA基因序列与以上已知的鸟类12S rRNA基因序列进行比对，以确定其在分子系统发育树中的位置。通过分析盔犀鸟12S rRNA基因序列的长度和A + T和G + C的含量，来理解其与生态环境适应性的关系。使用Mega 7软件，计算各位点的转换与颠换值以及其比值。比较盔犀鸟与其它鸟类的12S rRNA基因密码子使用偏好，以探究这种偏好是否为盔犀鸟所特有，或者是否是其在演化过程中的一种适应性变化。使用MEGA7软件进行序列多重比对，并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

在电泳检测中可获得清晰无杂质条带，如下图所示。

注：M为DL2000DNA相对分子质量标准，1-2为12S1，3-4为12S2，5-6为12S3

在PCR扩增阶段，严格遵循优化的反应条件，包括预变性温度、变性温度、复性温度及循环次数，确保了12S rRNA基因片段的特异性扩增。扩增结束后，通过凝胶电泳对产物进行分析，观察到清淅的单一目标条带，其大小与预期的各基因片段一致，没有观察到非特异性扩增或杂质条带。

2.2 碱基组成及替换分析

在深入研究盔犀鸟的12S rRNA基因序列中，碱基组成和替换分析扮演着至关重要的角色，它们提供了关于基因结构、物种间遗传差异以及适应性选择的宝贵信息。在这部分研究中， 首先对盔犀鸟的12S rRNA基因序列进行了全面的碱基组成分析，包括A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）和G（鸟嘌呤）四种碱基的比例。结果表明， 盔犀鸟的12S rRNA基因序列展现出独特的碱基组成特征，与已知的其他鸟类序列存在显著差异，这可能与其独特的生理功能和生活环境有关[1]。

如表2所示，这些位点中，A，T，C，G 碱基均含量分别为30.8%，19.6%，29%，20.7%。盔犀鸟12SrRNA序列中A，T，C，G 碱基含量分别为29.9%，18.5%，29.6%，21.9%。其中A +G 含量为51.8%，近似于 T + C含量为48.1%。参考鸻形目 20 种鸟类的12S rRNA 基因序列分析研究，鸻形目20种鸟类的12S rRNA 基因的全序列，经比对后共有1031bp，A、T、C、G 四种碱基的含量分别为 31.4%、21.4%、26.9%、20.2%左右，嘌呤碱基含量 51.6%略高于嘧啶碱基的含量 48.3%[2]。实验所测定盔犀鸟12SrRNA基因序列嘌呤碱基数和嘧啶碱基数与鸻形目鸟类的12SrRNA基因序列嘌呤碱基数和嘧啶碱基数相似。

使用Mega 7软件，计算各位点的转换与颠换值以及其比值。由结果可知，转换与颠换在密码子第1、2、3位点上的发生情况相似，转换值均在31-32，颠换值均在10左右。全体位点转换与颠换的比值（R）为 3.03，密码子第 1、2 、3 位点R值分别为 2.62、3.43 、3.14，无论整体还是密码子各位点，其R值均在3左右，转换值高于颠换值，表现出较为明显的转换饱和，说明在构建系统发育树时应考虑转换和颠换的发生比率[3]。同时该结果说明这段基因可靠度高，使用该基因得到的进化树可靠度高。参考鸻形目 20 种鸟类的12S rRNA 基因序列分析研究，鸻形目鸟类 12S rRNA 基因有较多的缺失和插入，碱基替换中转换数高于颠换数，发生转换的频率大概是颠换的 3.3 倍[4]，与本文实验所测盔犀鸟12SrRNA基因的R值接近。

注：在上表中Avg表示平均频率，1st表示第 1 位点，2nd表示第 2 位点，3rd表示第 3 位点，ii表示相同碱基，si表示转换碱基，sv表示颠换碱基，R表示转换碱基和颠换碱基的比值。

通过上述分析，可以发现盔犀鸟的12S rRNA基因序列在碱基组成、替换模式都呈现出独特的特征。这些差异可能反映了盔犀鸟在漫长的进化过程中，为了适应其独特的生态位和生理需求，而经历的分子演化。这些研究结果有助于进一步研究盔犀鸟的遗传特性和适应性特征，对于构建更精确的鸟类进化树具有重要意义。

2.3 密码子偏好性分析

在对盔犀鸟12S rRNA基因序列的分析中，深入研究其密码子使用偏好，以揭示可能影响蛋白质合成效率和适应性选择的机制。密码子偏好性通常体现在不同物种之间偏好的不同，这些偏好可能源于基因组的进化、翻译效率的优化或者与特定环境因素的相互作用[5]。

进一步比较了盔犀鸟与其它鸟类的12S rRNA基因密码子使用偏好，以探究这种偏好是否为盔犀鸟所特有，或者是否是其在演化过程中的一种适应性变化，分析盔犀鸟与参考物种之间的密码子使用差异，发现盔犀鸟的密码子偏好与某些特定的鸟类群体显著不同，这可能反映了盔犀鸟对特定环境条件的适应。

结合盔犀鸟的环境适应特征，如在热带雨林中的生活习性，以及其可能面临的食物短缺或疾病压力，推测密码子偏好可能与其对这些压力的应对机制有关[6]。

通过Mega 7软件对密码子偏好性开展研究，结果如表4所示。所有密码子的频率在1.1-13.1之间，其中UCU（S）的频率最小，CCC（P）的频率最大。相对同义密码子使用度在0.32-2.51之间，使用度最小和最大的密码子分别为UCU（S）和AGC（S）。

密码子偏好性分析不仅揭示了基因的翻译效率特征[7]，还提示了其可能的环境适应性策略。通过与其它鸟类的比较，探究盔犀鸟在演化过程中是如何利用基因表达的精细调控来适应其特定的生活环境。

2.4 遗传距离分析

在本研究中，采用盔犀鸟12S rRNA基因序列与已知鸟类数据集中的12S rRNA序列进行比较，以计算盔犀鸟与其他鸟类的遗传距离。遗传距离的测量有助于理解盔犀鸟在鸟类系统发育树中的位置，以及物种间的分化程度。

运用K2P模型作出遗传距离研究，如表5所示，盔犀鸟与其他15种鸟类的遗传距离处于0.114-0.178，样本平均遗传距离为0.149（表5）。其中，盔犀鸟与银颊噪犀鸟和巽他皱盔犀鸟所呈现出的遗传距离最小，仅为0.114，亲缘关系较近。盔犀鸟与大溪地矶鹬所呈现出的遗传距离最大，为0.178，亲缘关系较远。盔犀鸟12SrRNA基因与其近缘物种遗传距离较大，在设计鉴定盔犀鸟的引物时可考虑选择该基因。

盔犀鸟与犀鸟科的其他成员遗传距离较近，这与它们的经典分类学地位相吻合。然而，盔犀鸟与某些远缘鸟类的遗传距离较大，这可能反映出它们在进化历程中的分歧。通过比较盔犀鸟与其他鸟类的遗传距离，进一步理解盔犀鸟在鸟类演化史中的位置，以及盔犀鸟特有的生理特性和生态适应性如何影响其基因组的进化。

遗传距离分析结果为盔犀鸟的系统发育关系提供了有力的支持，有助于认识盔犀鸟在鸟类演化中的独特地位，对于物种分类研究具有重要的理论意义[8]

2.5 系统发育树分析

从图2可以看出，16个样本的12SrRNA序列在系统发育树上组成不同的分支。目标样本的基因序列与银颊犀鸟聚为一支，说明亲缘关系最近，其次是与马来犀鸟、巽他皱盔犀鸟、扭嘴犀鸟、东方斑犀鸟、冠斑犀鸟亲缘关系较近，与林地翠鸟等5个物种的亲缘关系相对最远。

本研究结果不仅有助于通过分子生物学的视角了解盔犀鸟的演化历史，也为深入研究其生态适应性和物种分化提供了新的视角。此外，系统发育树的构建还有助于确定盔犀鸟在保护生物学中的地位。

结语

在本研究中，测定了盔犀鸟的 12SrRNA序列，并对其进行了详尽的生物信息学分析。与其他15种鸟类的12SrRNA序列比较，就碱基组成来说，A，T，C，G 碱基平均含量分别为29.9%，18.5%，29.6%，21.9%。A + T 含量为48.4%，近似于 G + C含量为51.6%，A + T和G + C不显著，能够满足鸟类12SrRNA基因碱基特性。就碱基替换来说，第 1，2 和 3 位点的 R值分别为 2.62、3.43 和3.14。通过密码子各位点进行分析，无论整体还是密码子各位点，其R值均在3左右，转换值高于颠换值，表现出较为明显的转换饱和。从密码子偏好情况而言，更偏好CCC（P）。

就遗传距离来说，所有序列的遗传距离符合实际，盔犀鸟与其他15种鸟类的遗传距离处于0.114-0.178，样本平均遗传距离为0.149。

遗传距离分析和系统发育树构建进一步证实了盔犀鸟在鸟类谱系中的独特地位，以及与其他犀鸟科成员的紧密关联，这与传统的分类学观点一致。本研究的成果在打击非法野生动物交易方面，盔犀鸟12SrRNA序列的分析方法可以作为DNA物种识别技术的一部分，用于验证交易的角质头盔。

参考文献

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[2] 郭华. 基于12S rRNA基因的鸻形目20种鸟类基因序列变异分析及其系统发育研究[D]. 河北师范大学， 2012.

[3] 任岗. 中国沙塘鳢属鱼类线粒体12S rRNA基因序列分析[J]. 水生生物学报， 2007（4）： 473-478.

[4] 郭华. 基于12S rRNA基因的鸻形目20种鸟类基因序列变异分析及其系统发育研究[D]. 河北师范大学， 2012.

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