在不同水环境下三黄散对副溶血弧菌体外抑制效果的研究

摘要：本试验探讨了三黄散在不同水环境（盐度、pH、温度）下对副溶血弧菌的体外抑制效果。通过测定最低抑制浓度（MIC）、分析生长曲线及模拟不同水环境条件，发现三黄散对副溶血弧菌的MIC为32 mg/mL，且熬煮后的三黄散抑菌效果更优。在盐度0‰～30‰、pH 6～9及温度20～30℃范围内，三黄散均表现出显著抑菌活性，其中20℃时生长抑制率最高（未熬煮65%，熬煮68%）。

关键词：中草药；三黄散；副溶血弧菌；体外抑菌

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，对水产养殖动物危害严重[1]。为水产品及人类安全考虑，寻求抗生素的替代药物迫在眉睫。三黄散（含有大黄、黄柏、黄芩）药性均苦，性寒，有清热燥湿，泻火解毒，提高机体免疫力的功效[2-3]，常用于水产动物细菌性败血症，肠炎等的防治[4]，但使用不当会起到发作用[5]。而且三黄散在不同水环境和使用方法对弧菌的抑菌效果暂未见报道。基于此，本试验针对在不同水体条件以及三黄散的不同使用方法下，研究能够使其发挥最大抑制弧菌效果的水体条件，以提高治疗效率。

1材料与方法

1.1试验材料

副溶血弧菌由天津农学院营养与饲料实验室提供。三黄散由利洋水产公司生产。

1.2试验方法

1.2.1副溶血弧菌菌种活化与MIC的测定

将副溶血弧菌菌种活化后用LB肉汤将菌液稀释至1×108 CFU/mL备用。并将三黄散配置成药液进行熬煮，熬煮与未熬煮的三黄散的浓度分别为1、2、4、8、32、64、128、256 mg/mL。使用二倍稀释法测定三黄散对副溶血弧菌的最低抑制浓度MIC（Minimum Inhibitory Concentration）。熬煮后的三黄散药液同以上方法测定。

1.2.1三黄散对副溶血弧菌生长曲线的影响

将菌液与最低抑制浓度三黄散药液各100 μL加入至96孔板中，对照组只加菌液与培养基，空白组只加入药液。每组设置三个重复。每隔2 h取样，测定24 h内三黄散对其生长的影响。

1.2.3不同水环境条件下三黄散对副溶血弧菌的抑制效果

分别配置盐度0‰，10‰，20‰，30‰，pH为6、7、8、9的培养基加入于5 mL的EP管中，并接种3％稀释好的菌液于试管中，继而使用最低抑菌浓度的熬煮与未熬煮过的三黄散药液加入试管中（菌液与药液比为1∶2），于37℃恒温培养24 h。温度组则使用正常LB肉汤，加入菌液与药液后，分别放置于20℃、25℃、30℃的恒温培养24 h。培养后分别测定OD600吸光值，进而 计算不同水环境下三黄散对副溶血弧菌的生长抑制率。

2结果与讨论

2.1试验结果

2.1.1三黄散对副溶血弧菌的最低抑制浓度（MIC）

由表1可知，通过二倍稀释法，浓度低于32 mg/mL三黄散药液熬煮与否，副溶血弧菌经24 h的培养均有不同程度的增殖，培养液出现不同的浑浊程度；而三黄散药液达到或高于32 mg/mL时，副溶血弧菌培养24 h后，肉眼观察不到培养液有浑浊现象。可见，三黄散对副溶血弧菌的MIC为32 mg/mL，抑菌效果良好三黄散中，黄芩乙酸乙酯萃取物对抗菌活性的发挥起十分重要的作用[2]。三黄散也对嗜水气单胞菌等菌具有较好抑菌能力[6]。

2.1.2三黄散对副溶血弧菌生长曲线的影响

由图1可知，三黄散处理后的副溶弧菌菌液在生长的前2 h与未处理组生长趋势基本相似。8 h后，药物处理组生长速度明显降低，且在之后的12 h内，副溶血弧菌保持平稳增长。可见，三黄散对副溶血弧菌有显著的抑菌效果且在副溶血弧菌生长的前8h效果更加显著。三黄散显著抑制了副溶血弧菌的生长，说明三黄散的三种成分，大黄，黄芩，黄柏可作为天然有效的抗菌剂。在实际用药过程中，还要考虑剂量及鱼体大小等多种因素[7]。

2.1.3不同水环境条件下三黄散对副溶血弧菌的抑制效果

由表2可知，在不同温度，pH，盐度条件下，三黄散对副溶血弧菌的抑制作用不同，而三黄散是否经过熬煮对其抑菌效果也有偏差。在温度不同时，熬煮与未熬煮过的三黄散对副溶血弧菌均在20℃时表现出较高的生长抑制率。在pH不同时，未熬煮过的三黄散在pH为6、7时对副溶血弧菌的抑制率略高，而熬煮过的三黄散则在pH为7时生长抑制效果良好。在盐度不同时，熬煮与未熬煮过的三黄散对副溶血弧菌的生长抑制率并无显著差别，但三黄散熬煮后对副溶血弧菌的抑制率稍高与未熬煮的。而三黄散熬煮后对副溶血弧菌的平均生长抑制率总体来说高于未熬煮。研究表明，中草药熬煮时可溶解药材中的有效成分，如多酚、黄酮类化合物和儿茶素等，它们具有抗氧化、抗炎等药理作用[8]。合理控温是有效提高三黄散对副溶血弧菌抑制效果的重要途径之一。

参 考 文 献

[1] 李文霞.水产健康养殖理念与发展对策的探讨[J].农家致富顾问， 2020 （8）：199-199.

[2] 喻运珍，王小玲.黄芩甙对草鱼肝功能及免疫机能的影响[J].水利渔业， 2006（3）：97-98.

[3] 杨丽，胡长胜，马成芳等.黄芩和大黄提取物在羊体内外抑菌作用[J/OL].草业科学，1-26[2025-04-08].

[4] 农业农村部办公厅关于实施水产绿色健康养殖技术推广“五大行动”的通知[J].中华人民共和国农业农村部公报，2021（5）：112-114.

[5] 王玉堂.中草药及其在防治水产动物疾病中的应用（连载二）[J].中国水产，2014（7）：55-57.

[6] 詹建举，邓松，赵涛等.三黄散对嗜水气单胞菌的治疗作用研究[J].四川农业科技， 2024（2）： 72-74.

[7] 王秀芹，张素青，王德兴等.中草药在水产动物病害防治的应用及存在问题[J].科学养鱼，2016 （11）： 55-57.

[8] Nacima Lachkar， F. Lamchouri et al. Ethnopharmacological Survey， Mineral and Chemical Content， In Vitro Antioxidant， and Antibacterial Activities of Aqueous and Organic Extracts of Chamaerops humilis L. var. argentea Andre Leaves. BioMed Research International（2022）. Hindawi.

[ 受大学生创新项目（202310061206）和ITTFRS2022000-011项目资助；*通讯作者，教授，博士。]