降盐碱菌的筛选及性能测定

1 前言

土壤退化为盐碱地威胁着全球农业。干旱地区用含盐地下水灌溉、排水不当，叠加潮汐、海平面上升等影响，致使盐碱土壤增多、耕地减少。山东的重度盐碱地集中在西北沿海和黄河三角洲地区，因过度开垦致盐渍化加剧，此地治理意义重大。

我国干旱半干旱地区土壤盐碱化问题突出，盐渍化程度高、种类复杂、分布广且盐碱化速度加快。盐分超 0.5% ，作物根系吸水难，生长发育受阻、减产。盐碱度过高影响植物生长全过程。

目前土壤改良方法多样，物理改良如地面覆盖可抑制盐分表聚，但地膜有污染；化学改良效果显著但成本高、易污染；生物修复利用微生物和耐盐碱植物，能降低盐碱含量、改良结构，微生物肥料还可多方面提升土壤质量。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

山东省东营市垦利区盐场附近盐碱土壤，采集地下 5～15cm 非植物根际盐碱土壤，标记该为20 号。

2.2 实验方法

2.2.1 菌株分离纯化

取 10g 土样加无菌水震荡、静置后，取上清稀释为 10-1～10-3倍土壤浸出液，涂布于 pH=7、1%NaCl 的 LB 培养基平板， 37% 培养16～48 h，挑取单菌落划线编号制作菌种库。

2.2.2 耐盐碱菌株的筛选

将菌株接种于 pH9-5%NaCl、pH9- 10% 、 pH10-5% 和 pH10-10% 的4 种培养基上观察其生长状况。

2.2.3 菌株降碱率的测定

将上述耐盐碱菌接种于 pH9 的 LB 培养基中，28℃，180 转，24h，每隔 6 h 取发酵液，用 pH 计测量 pH 值，并依据以下公式计算降碱率。

菌株降碱效率 n= （初始pH- 最低 pH ）/ 初始 pH×100%

式中：初始 pH 为灭菌后未接种菌株时液体培养基的酸碱度；最低pH 为反应过程中菌株降解后液体培养基最低酸碱度。

2.2.4 菌株降盐率的测定

将上述耐盐碱菌株接种于含 5%NaCl LB 的培养基中，28℃，180r/min，96h，每隔 12h 取发酵液，用盐度计测量各个时间的盐度，并依据下公式计算降盐率。

株降盐效率 n= （初始盐度- 最低盐度）/ 初始盐度 ×100%

2.2.5 菌株种属鉴定

将菌株接种于摇菌管中，培养 12～16h ，送至上海生工有限公司进行 16S rDNA 序列测定。通过 NCBI 和 MAGE7 进行序列比对，明确目标菌株的种属。

3 结果与分析

3.1 菌株盐碱耐受力的测定

随着 pH 值的不断升高，菌株的生长会受到抑制，不同菌株的耐碱能力不一。实验发现，大多数菌株在 pH 8-9 下仍可正常生长，当pH 升高至 10-11 时，部分菌株的生长严重受抑，但仍有 19 株菌种在pH11 时生长状况良好，即为耐碱菌。

将 36 株菌接种于盐浓度（ 5% 、 10% 、 15% 、 20% ）的培养基上，发现随着盐度的上升，存活的菌株越来越少，实验发现 16 株菌种在15% 盐浓度平板上依 旧生长良好，即为耐盐菌。

3.1.1 菌株对盐碱双胁迫耐受力测定结果

取土壤稀释液涂布于LB 平板上，获得79 株细菌的菌库，将菌株转至含 5%NaCl 的培养基上进行初筛，得到36 株耐盐菌种。

对上述菌株进行盐碱双胁迫实验，筛选耐盐碱的菌种。8 株在pH10-5% 和 pH9-10%NaCl 培养基上均生存较好，即为耐盐碱菌（图1A）。

3.2 菌株降碱、降盐能力的测定

将上述 8 株耐盐碱菌在 pH9 的 LB 培养基上生长 24h，每隔 6h测定 pH 值，并计算降碱率。8 株菌都均有将碱的能力，且多数菌在生长 12h 时，降碱率达到最高值，其中 C-3 和 C-9 的降碱效果最好，达到了 14% 以上（图1B）。

将 8 株菌株在 5% NaCl 的培养基上生长 3 天，每隔 12h 测一次培养基的盐度，并计算降盐率。如图 1C 所示，C-3 和 C-9 在 12h 时有降盐效果，但随培养时间延长，菌株的降盐效果会减弱；菌株 D-5在培养36h 时开始降盐，随培养时间的延长，降盐能力提高。

根据 24h 降碱和 96h 降盐时间进程实验的结果，计算每个菌株的最高降碱率和最高降盐率，最终统计结果表明菌株 C-3、C-9 和 D-5具有降盐碱的能力（图1D）。

3.3 菌株的种属鉴定

对 C-3、C-9 和 D-5 进行 16S rDNA 测序，使用 MEGA7 对其进行系统发育分析。发现三株菌株均为芽孢杆菌，其中 C-3 与 Bacillusstratosphericus 亲缘关系近；C-9 与 Bacillus zhangzhouensis 亲缘关系近；D-5 与 Bacillus pumilu 亲缘关系近。

4 展望

本研究聚焦东 营黄河三角洲重度盐碱地，在高碱、高盐及高盐碱多重胁迫下筛选耐盐碱菌株，测定 其降盐、降碱能力，成功锁定 3 株有降盐碱潜力的芽孢杆菌。不过研究尚有拓展空间， 未来可探究这 3株菌株在实际改良中的成效，明晰与其他改良举措的协同机 理，挖掘更多菌株资源。

参考文献

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作者简介：王秋如（ 2004- ），女，汉，山东潍坊人，正主席，本科在读 生物信息学方向。

通讯作者：许亚文（1994-），女，汉 ，山东日照人，生命科学学院学生工作办公室 （ 团总支 ） 主任 （ 书记 ），硕士研究生，济 宁医学院，研究方向： 思想政治教育。