HPLC 法测定石榴籽中安石榴苷的含量

Abstract ：We developed a method for determining 7 Polyphenols in Tea by High Performance Liquid Chromatography （HPLC）. Used 50% methanolwater for extracted the sample， and then analyzed by HPLC. Results showed that： the recoveries of standard addition ranged from 91. 7% to 104.2% with relative standard deviation （RSD） of 0.86%^-2 . 41%. . The linear relationship was good with determination coefficients in the 7 Polyphenols. The limit of quantification was between 0.008 and 0. 027mg/g . This method was suitable for the determination of the 7 Polyphenols in Tea.

Keywords： Tea; High Performance Liquid Chromatography（HPLC）；Polyphenols

安石榴苷是石榴皮多酚的主要成分，有 α、β 两种结构。其是一种可水解的单宁，可从使君子科橄榄树的叶片，诃子等少数植物中分离得到，为石榴皮中较为特异性的成分。石榴皮是石榴科植物石榴的干燥果皮，为我国传统中药材，具有涩肠止泻、止血、驱虫的功效，可以用于治疗久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、带下、虫积腹痛等疾病。由于石榴皮中的安石榴苷具有上述较好的疗效，因此开发测定石榴皮中的有效成分越来越受到国内外学者的广泛关注。本文建立了一种 HPLC 检测方法，用于测定石榴皮中的安石榴苷含量，并对不同产地的石榴皮中的安石榴苷进行含量测定，为进一步开发利用石榴皮资源提供一定的参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

样品：采购不同产地市售石榴皮样品，干燥后用粉碎机打碎，过60 目筛。

仪器：Agilent 1260 高液相色谱仪（配 DAD 二极管阵列检测器，美国Agilent 公司）；Waters Symmetry C18 色谱柱（（250mm×4.6mm i.d.， 5 μm，美国 Waters 公司）；AB204-S 型电子天平（感量：0.0001g，瑞士 Mettler-Toledo 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国 Millipore 公司）； 0.45μm 水相微孔针筒过滤膜（ Φ13mm ，天津市津腾实验设备有限公司）。

试剂：三氟乙酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；水为自制超纯水。安石榴苷（安石榴苷：含量 ⩾98.82% ，成都曼思特生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 工作曲线制作

精密称取安石榴苷标准品 10.0 0mg，置于 10 mL 容量瓶中，用 50% 甲醇 -水溶解并定容，即得到到浓度为 1000μg/mL 标准储备液。安石榴苷（α 安石榴苷、β 安石榴）两个峰的比例和温度有关，在水溶液中是互变异构体，且达到动态平衡，由所配制得到的得标准品溶液，进行液相色谱分析，面积归一化法得到 α 安石榴苷的比例为 45.36%、β 安石榴的比列为 54. 64% ，根据相应的比例，即可算出其占有的浓度；然后移取适量标准储备液，用 50% 甲醇 - 水定容至一定体积，即得安石榴苷中 α 安石榴苷、β 安石榴浓度范围约为 1、5、10、20、50、的标准工作溶液。

1.2.2 样品分析

称取约 0.1g（精密至 0.001g ）样品粉末于 100 mL 具塞锥形瓶中，加入50 mL 50% 甲醇醇水溶液称重，浸泡 1h，室温条件下超声（功率 200W，频率40kHz）提取 30min，冷却静置至室温，补重，取上层清液，经 0.45μm 滤头过滤后，进HPLC 液相色谱仪分析。

HPLC 条件：色谱柱：Waters Symmetry C18 色谱柱；流速：0.6mL/min，流动相：流动相A ：0. 2% 三氟乙酸水溶液，流动相B ：乙腈；

洗脱梯度：0＼～16min ： 90% ；16.01＼～19min ： 30% A 30%19.01＼～24min ：90% A → 90%A 柱温：30 ℃ ；进样体积 10 μL ；检测波长258nm。

2 结果与讨论

采用 0.2% 三氟乙酸水溶液 - 甲醇作流动相，有 α 安石榴苷、β 安石榴苷不能获得完全得到的分离，而且峰拖尾严重。这是因为安石榴苷容易和甲醇形成缩甲醛反应。改用 0.2% 三氟乙酸水溶液 - 乙腈作为流动相，α 安石榴苷、β 安石榴苷能达到较好的分离效果，分离度大于 1.5，峰形良好，能满足定性与定量的要求。本实验采用等度洗脱最终优化得到1.2.2 分析条件，在该条件下，安石榴苷（α 安石榴苷、β 安石榴苷）标准品的色谱图（见图1）。

2.2 提取溶液的优化

称取含有一定加标量样品后，试验选择了甲醇、 50% 甲醇 - 水、二氯甲烷为萃取溶剂，按1.2.2 进行分析，采用回收率对样品萃取进行评价，结果显示（表1）， 50% 甲醇- 水溶液提取效果较好。因此，选择 50% 甲醇- 水作为提取溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 工作曲线及检测限

采用优化确定的 1.2 条件进行 HPLC 分析，以相应浓度 x（μg/mL ）对其峰面积 y 进行拟合曲线，并分别按 3 倍信噪比（S/N）和 10 倍 S/N 计算检测限，包括检出限和定量限，结果见表 2，可见，各物质线性关系 R²⩾0 .995，说明均具有较好的线性关系；安石榴苷 α 仪器检出限为 0.0554μg/mL ，仪器定量限为 0.184μg/mL ；安石榴苷 β 仪器检出限为，仪器定量限为0.310μg/mL。安石榴苷 α 方法检出限为 0.0277mg/g ，方法定量限为 0.922mg/g ；安石榴苷β 方法检出限为 0.0466mg/g ，方法定量限为 0.155mg/g 。

表2 方法线性回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.3.2 准确性和稳定性

选择已知浓度的样品作为本底样品，在本底样品中准确加入低、中、高 3个浓度的混标，然后进行分析，采用回收率和精密度作为该方法的准确性和稳定性的判定指标。结果（表 3）表明，3 个添加水平下，安石榴苷 α、安石榴苷 β 两种物质的回收率在 98.5 % ＼～ 104.6 % ，相对标准偏差（RSD， n=6 ）均小于 3.38% 。说明该方法准确、稳定。

2.4 实际样品分析

采用本方法测定了多个市购样品，石榴皮样品典型色谱图（见图 2），具体结果见表4。

3 结论

建立了测定石榴籽中安石榴苷含量测定的高效液相色谱（HPLC）分析方法。安石榴苷 α 方法检出限为 0.0277mg/g ，方法定量限为 0.922mg/g ；安石榴苷β 仪器检出限为 0.0466mg/g，仪器定量限为 0.155mg/g。，回收率在 98.5 % ＼～104.6 % 之间，相对标准偏差（RSD）在1. 20% ＼～ 3. 38% 之间。说明该方法灵敏度高、准确稳定、方便快捷，适合于石榴皮中安石榴苷的快速测定，可为石榴皮安石榴苷含量测定提供一种准确的检测方法。

参考文献

[1] 严鸿德 . 茶叶深加工技术 [M]. 北京：中国轻工业出版社， 1998.

[2] Marti-Mestres G， Mestres J P， Bres J， etal. The “in vitro”percutaneous penetration of three antioxidant compounds[J] .InternPharm， 2007， 331： 139-144.

[3] 向春阶 . 饮食与健康 [M]. 北京：东方出版社， 1997.

[4] 康海宁，陈波，韩超，等. HPLC 法测定茶叶水提液中五种儿茶素和咖啡碱及其用于茶叶分类的研究 [J]. 分析测试学报 . 2007， 26 （02）： 211-215.

[5] 戴军，王洪新，陈尚卫，等 . 茶叶及茶多酚中儿茶素的高效液相色谱分析方法研究 [J]. 色谱 . 2001， 19 （05）： 398- 402.

[6] 邸羿，孙小明，刘永峰，等 . HPLC 法测定茶叶中 10 种有效成分的含量 [J]. 分析试验室， 2013， 32 （3）： 106- 109.

[7] 张甜，董学畅，吴方评，等 . 固相萃取 - 高效液相色谱法测定烟草样品中 10 种多酚 [J]. 分析化学， 2005， 33 （3）： 359-362.

[8] 曾敏等 . 超声波辅助提取夏枯草多酚的研究前景 [J]. 云南化工，2018， 45 （3）： 3-4.

[9] 凌妲思，何友昭，谢海洋，等 . 双向电堆积与毛细管电泳联用对茶叶中咖啡酸及没食子酸的测定 [J]. 分析测试学报 . 2010， 29 （04）： 368-371.

[10] 曹玉华，张欣，丁祥欢，方禹之，叶建农 . 毛细管电泳 - 电化学检测测定茶叶中咖啡因、表儿茶素和抗坏血酸 [J]. 分析化学 . 2001，（09）：1072-1075.