miRNA-196a 通过 PI3K/AKT 信号通路诱导口腔癌转移的观察研究

Abstract：Objective To observe the expression differences of miR-196a and the related factors of PI3K/AKT signaling pathway in the adjacent normal tissues and oral squamous cell carcinoma tissues， and to preliminarily explore the relationship between miRNA-196a participating in the progression and invasion metastasis of oral cancer through the PI3K/Akt signaling pathway. Methods The experiment was divided into the group of normal tissues adjacent to cancer， the group of oral squamous cell carcinoma without lymph node metastasis， and the group of oral squamous cell carcinoma with lymph node metastasis； The pathological stage was determined by HE staining. The relative expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected by immunofluorescence. The relative expression levels of miRNA-196a， FOXO1， PI3K and AKT in each group were analyzed by qPCR. Results HE staining showed that the tumor broke through the basal layer to form cancer nests， intercellular bridges and keratin pearls were obvious， and the cell and nuclear pleomorphism was not obvious， showing mild atypia； The immunofluorescence results showed that the expression levels of p-PI3K and p-AKT gradually increased in the normal tissues adjacent to cancer， the oral squamous cell carcinoma group without lymph node metastasis， and the oral squamous cell carcinoma group with lymph node metastasis. The qPCR results indicated that the expression level of miRNA-196a gradually increased in the normal tissues adjacent to cancer， the oral squamous cell carcinoma group without lymph node metastasis， and the oral squamous cell carcinoma group with lymph node metastasis. Meanwhile， the mRNA expression level of FOXO1 gradually decreased. There was no significant statistical difference in the mRNA expression levels of PI3K and AKT. Conclusion The miRNA-196a and the key effector factor p-AKT of PI3K/AKT pathway were found to be highly expressed in the oral squamous cell carcinoma group with lymph node metastasis， At the same time， there is a binding site between p-AKT and miRNA-196a， suggesting that miRNA-196a plays a promoting role in the induction of oral cancer metastasis through the PI3K/AKT signaling pathway.

Key words： Oral squamous cell carcinoma； miR-196a； PI3K/AKT signaling pathway；

随着烟草和槟榔产业的发展，口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma， OSCC）患者的发病率逐年增加，其高发病率和高死亡率已经使其成为对患者生命构成严重威胁的重大疾病之一，而由OSCC的侵袭转移引起的重要器官功能丧失是肿瘤致死的主要原因[1]。由于OSCC的转移涉及从脱离原位到异位生长的多个环节，受许多因素的共同影响，现今对这些因素的认识远未达到全面的程度。目前对于恶性肿瘤的转移尚无十分有效的监测控制手段，因此对更多的转移相关因素做深入的研究，具有十分重要的意义。

miRNA-196a是miRNA中的重要成员，由同源异形盒基因家族（ HOX） 基因座转录而来，其在多种恶性肿瘤中异常高表达[2]，这种高表达与淋巴结受侵犯范围和相关疾病的分期存在密切关系。瘤体细胞产生的对化疗药物的某些不敏感现象也与其有关系。本文通过分析组织中miRNA-196a的表达情况与肿瘤增殖、侵袭功能的变化，研究其与OSCC 的关系，同时分析其是否通过磷脂酰肌醇3-激酶（ PI3K） /蛋白激酶B（ AKT） 信号通路发挥作用，为了解miR-196a机制，开发安全有效的OSCC 新型靶向针对性方法开拓新思路，初步探讨miRNA-196a通过PI3K/AKT信号通路参与OSCC淋巴结转移的可能机制，为后续制定口腔癌个性化治疗方案提供可靠靶点。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2019年9月至2021年9月于海南省人民医院口腔颌面外科住院手术患者蜡块，选取经手术后常规病理诊断为不伴淋巴结转移口腔鳞癌组织、伴淋巴结转移口腔鳞癌组织和癌旁正常组织各30例；HE染色结果经2名病理科医师明确诊断。本实验已通过医院医学伦理委员会讨论并获得批准同意。

1.2试剂和仪器

p-PI3K抗体、AKT抗体、IgG HRP标记兔二抗、一抗及二抗稀释液、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及嵌合荧光法快速定量检测试剂盒、qPCR引物序列合成、柠檬酸抗原修复液、苏木素染液、PCR扩增仪、荧光定量PCR仪、荧光显微镜。

1.3实验方法

1.3.1取材：实验取材自2019年9月至2021年9月于海南省人民医院口腔颌面外科住院手术患者蜡块，经切片机切片，切片放入60℃烘箱内烤干后取出备用；qPCR实验取材手术切除新鲜标本。

1.3.2HE染色：切片于二甲苯中脱蜡6次，依次入梯度酒精处理5分钟，后经濯洗、染液、水洗、分化、水洗、返蓝、慢洗、脱水，伊红染色15s，无水乙醇I、II、Ⅲ各级处理2min；透明；封片。

1.3.3免疫荧光：二甲苯I、II、III各8min脱蜡；乙醇浓液6min，水化5min，抗原修复。孕育一抗：一抗滴加至切片，4℃冰箱孵育过夜，翌日，PBS溶液清洗3次；后滴加二抗工作液，暗室孵育，DAPI复染、封片，荧光显微镜下观察并行采集图像。

1.3.4qPCR法：分析统计miRNA-196a、FOXO1、PI3K及AKT的mRNA相对表达量

新鲜标本根据总RNA提取试剂盒说明书提取癌旁正常组织、不伴淋巴结转移癌组织及伴淋巴结转移癌组织中的总RNA，利用分光光度测定仪计算。

引物序列：hsa-miR-196a（loop primer：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCAACAA，Forward：TGCGCTAGGTAGTTTCATGTTG，Reverse：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT）；U6（Forward：CGCTTCGGCAGCACATATAC，Reverse：AAATATGGAACGCTTCACGA）；FOXO1（Forward：ATAACTGTGCGCCTGGAC，Reverse：CTGTTGGGCTGGGCTAC）；PI3K（Forward：AGCTGGTTTGGATCTTCGGA，Reverse：CAGGTCATCCCCAGAGTTGT）；AKT（Forward：CTGCCCTTCTACAACCAGGA，Reverse：ATGATCTCCTTGGCGTCCTC）；GAPDH（Forward：TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG，Reverse：TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT）。按照反转录说明书获取cDNA。实验重复3次，根据实验数据统计出基因的相对表达量，最终统计结果是通过2－△△Ct公式建立。

1.4统计学分析：在本文中结果多组间比较采用One-way ANOVA分析，应用GraphPad  Prism 10软件进行分析并绘制直方图，结果以p＜0.05为差异有统计学意义。

2实验结果

2.1 HE染色结果

癌旁正常组织结构正常（图1 A、D、G示）。不伴淋巴结转移口腔鳞癌镜下可见组织肿瘤突破基底层浸润深至固有层形成癌巢且中央可见角化珠，细胞间桥和角化珠明显，核分裂象少，核固缩且核仁增大（图1 B、E、H示）。伴淋巴结转移口腔鳞癌组织镜下可见癌细胞穿透基底层浸润深入固有层聚集形成癌巢且中央可见角化珠，可见癌细胞核多型性和核分裂象少，核固缩且核仁增大，角化珠及细胞间桥尚明显（图1 G、H、I）。

图1癌旁正常组织（图A、D、G，50x、100x、200x），不伴淋巴结转移口腔鳞癌组织（图B、E、H，50x、100x、200x）及伴淋巴结转移口腔鳞癌组（图C、F、I，50x、100x、200x）的形态学变化。

2.2免疫荧光结果

p-Akt主在癌旁正常组织中微量表达；与癌旁正常组对比，不伴淋巴结转移口腔鳞癌组中p-AKT的表达量增加，差异具有统计学意义（P＜0.001，如图4B示）；与不伴淋巴结转移口腔鳞癌组相比，伴淋巴结转移口腔鳞癌组中p-AKT相对表达量升高，差异具有统计学意义（P＜0.001，如图2 A、C示）。

p-PI3K定位于基底层及黏膜下层的成纤维细胞及炎症细胞等。p-PI3K在癌旁正常组织中少量表达；与癌旁正常组对比，不伴淋巴结转移口腔鳞癌组p-PI3K的表达量增加，差异具有统计学意义；与不伴淋巴结转移口腔鳞癌组对比，伴淋巴结转移口腔鳞癌组中p-PI3K的表达量增加，差异具有统计学意义（P＜0.001，如图4B、D示）

图2 癌旁正常组织、不伴淋巴结转移口腔鳞癌组及伴淋巴结转移口腔鳞癌组中p-AKT、p-PI3K蛋白的相对表达量（A、B图示免疫荧光x400）

2.3qPCR结果

结果显示，miRNA-196a在癌旁正常组织、不伴淋巴结转移口腔鳞癌组织及伴淋巴结转移口腔鳞癌组织中均有表达；与癌旁正常组织对比，不伴淋巴结转移口腔鳞癌中的表达升高；与前两者相比，伴淋巴结转移口腔鳞癌组织中相对表达量升高更为显著，差异具有统计学意义（P＜0.001，如图3 A示）。与癌旁正常组织相比，FOXO1 mRNA在不伴淋巴结转移口腔鳞癌及伴淋巴结转移口腔鳞癌组织中表达下降，且在伴淋巴结转移口腔鳞癌组织中下降更显著，差异具有统计学意义（P＜0.001，如图3 B示）。PI3K及AKT的mRNA表达量在癌旁正常组织、不伴淋巴结转移口腔鳞癌及伴淋巴结转移口腔鳞癌组织均表达，但无明显统计学意义（如图3 C、D示）。

图3 癌旁正常组织、不伴淋巴结转移口腔鳞癌及伴淋巴结转移口腔鳞癌的miRNA-196a、FOXO1、PI3K及AKT的mRNA相对表达量

3讨论

口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤，具有发病率高，治愈率低的特点，目前临床治疗手段仍以手术切除病灶，辅以化学药物治疗及放疗，但由于该疾病易发生淋巴结转移，导致患者治愈效果不佳，生存率低下，对患者的预后、生存质量影响甚广，目前OSCC尚无更精准的特异性靶向治疗药物，因此，迫切需要探寻一种稳定可靠的肿瘤生物标志物，力求在OSCC的临床精准化治疗、预后以及恢复患者术后生活质量方面发挥作用。

癌症因其独特的遗传、分子和临床异质性而与众不同[3]，这是由于不同患者的生活方式和个体基因表达的差异造成的。最近，分子图谱已经确定约26%肿瘤是由基因突变引起的，这些基因对癌症的发展具有约80%的终身风险[4]。miRNA-196a作为miRNA中的重要成员，其在多种恶性肿瘤中异常高表达[2]，且这种高表达与淋巴结受侵犯范围和相关疾病的分期存在密切关系。miR-196a 已经表明与头颈部鳞癌、食管鳞癌等恶性肿瘤的关系发生发展关系密切，但是在OSCC中影响肿瘤细胞的迁移、侵袭作用机制尚不明确。我们的研究表明，在OSCC初期的病例中，其miR-196a 整体数值明显升高，这种升高程度在淋巴结转移的病例中尤为显著，伴淋巴结转移OSCC与不伴淋巴结转移OSCC相比，统计学存在明显差异，这种现象与Singh K等人的研究[5]相似，其研究口腔癌病例发现miRNA-196a的表达明显高于邻近正常组织，且在临床和病理TNM分期为晚期OSCC组织中，miRNA-196a的表达增加更显著。验证了miRNA-196a可能有希望作为肿瘤侵袭、转移的生物标记物。此外，在头颈部鳞状细胞癌病例中，Dioguardi M[6]等通过系统性回顾分析发现与对照组相比发现miR-196a低表达的HNSCC患者的总生存率更高，miRNA-196a与良好预后相关，表明miRNA-196a在增强HNSCC患者治疗敏感性方面的潜在作用，验证了miRNA-196a可能预测HNSCC患者生存率的独立预后生物标志物。miRNA-196a不仅仅在头颈部鳞癌及食管鳞癌中呈现异常表达，在宫颈癌中亦具有相似的作用。在一项宫颈癌细胞研究中发现抑制miR-196a的表达可显著减少细胞的增殖、迁移和侵袭，并提高细胞凋亡途径的活性[7]。更有研究表明，在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌样本中也证实了miR-196a的过度表达，在宫颈癌中发挥促癌作用[8]。综上所述，miR-196a这种数值不仅在头颈部鳞癌等多种癌症进展中呈现异常表达情况，在口腔癌中亦同样呈异常高表达，这种异常表达跟病例的临床生命周期紧密联系，这提示我们miR-196a 在口腔肿瘤中可能发挥促癌作用。

PI3K/AKT信号通路是最重要的细胞内信号转导通路之一， Akt被激活后，磷酸化的Akt还能作用于PI3K/AKT下游效应物及下游靶标FOXO1等，在肿瘤增殖、侵袭及转移过程中发挥促癌作用[9]。特别是作为PI3K/AKT信号通路的下游关键因子FOXO1，广泛存在于真核哺乳生物中[10]，许多关键细胞活动受其调控，FOXO1失活或磷酸化FOXO1表达增加往往会导致肿瘤发展[11]。目前认为FOXO1是一种抑癌基因，该基因表达的下降将激活并促进肿瘤的进展，其低表达与肿瘤的恶性进展、淋巴结转移密切相关。我们的研究结果显示，在伴淋巴结转移OSCC组织中miRNA-196a呈现高表达，而PI3K/AKT关键效应因子p-AKT以及磷酸化FOXO1同时呈现高表达。三者间升高曲线相符，表明miR-196a也许是通过激活PI3K/AKT信号通路，促使该通路下游因子发挥促癌作用，从而诱导OSCC转移的发生。这与Song H等[12]的研究结果相似，其研究通过对SCC9细胞转染miR-196a抑制剂，可显著抑制磷酸化p-PI3K和p-Akt的表达，并提高FOXO1的水平；同时miR-196a模拟物显着增强SCC9细胞的增殖和迁移，表明miR-196a在OSCC中起癌基因的作用。这与我们的研究结果不约而同。说明miRNA-196a与PI3K/AKT通路相关因子结合后，激活该通路，从而促进乳腺癌进展并与癌症侵袭转移存在联系。此外，有研究发现[13]在卵巢癌中，miRNA-196a呈现异常过表达，miRNA-196a靶向介导DDX3的表达下调通过 PI3K/AKT 通路促进卵巢癌细胞的增殖并抑制细胞凋亡，证实了miRNA-196a通过PI3K/AKT通路在卵巢癌侵袭转移进展中的可能机制。相似地，Guerriero I等人[14]利用miRNA 图谱分析显示出24个差异性基因表达，其中miR-196a 呈现最显著持续上调。这些研究结果与我们的研究结果是相似的，都发现在多种癌症侵袭转移过程中miRNA-196a呈现高表达，并且PI3K/AKT关键效应因子同时呈现高表达。两者间升高趋势相符。表明miR-196a也许是通过PI3K/AKT信号通路诱导肿瘤的发生及侵袭转移进。与此同时，我们实验进一步研究显示，作为PI3K/AKT信号通路的下游关键因子FOXO1表达随病变程度逐步下调。

在本文研究中发现p-AKT、p-PI3K的表达量在伴淋巴结转移口腔鳞癌中异常高表达，说明PI3K/AKT信号通路被激活，该通路被激活后导致p-AKT活化发挥促进肿瘤进展；同时，磷酸化FOXO1表达同样呈现异常高表达，说明FOXO1受到生物刺激后，出核入细胞浆发挥效应作用，而FOXO1作为PI3K/AKT信号通路的下游关键因子的同时，其与miRNA-196a同样存在结合位点，miRNA-196a 与FOXO1结合后，激活PI3K/AKT信号通路释放，起到促进肿瘤进展并与细胞行为存在联系，参与影响肿瘤转移。本研究揭示了miRN-196a可能通过PI3K/AKT信号通路在诱导口腔癌转移过程中发挥促进作用，PI3K/AKT信号通路的激活及miRNA-196a异常高表达有望为后续制定口腔癌个性化治疗方案提供可靠靶点。

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基金项目：海南省卫生健康行业科研项目（编号：22A200001）