基于质谱的 SspB 介导 AlgU-MucAcyto 降解产物谱分析

引言

在细菌应激响应与生理调控中，sigma 因子 Alg[J 的活性受其与抑制蛋白MucA 的相互作用严格调控。AlgU-MucA 复合物的降解是释放 AlgU 活性的关键步骤，而 SspB 在这一降解过程中可能通过靶向识别发挥介导作用。目前，关于 SspB 如何精准调控该复合物降解的具体路径及产物特征，仍缺乏系统性的实验解析。

1 实验材料与方法

实验所用菌株为携带 融合基因的大肠杆菌 BL21（DE3），表达载体为 pET-28a （+ ），含 His₆ 标签便于蛋白纯化。SspB 蛋白由实验室保存的 pET-32a-SspB 重组质粒诱导表达。主要试剂包括 IPTG（Sigma）、Ni-NTA 亲和层析树脂（Qiagen）、PBS 缓冲液（pH7.4）及质谱级乙腈（Thermo）。蛋白表达通过 0.5mMIPTG 在 37℃诱导 4h 实现，经 Ni-NTA 柱层析纯化后，用 BCA 法测定浓度并通过 SDS-PAGE 验证纯度。降解反应体系含 5μ MAlgU-MucAcyto、2μ MSspB 及 1mMATP，于 37℃孵育不同时间（ 0～120min ）。反应产物经胰酶消化后，采用 QExactiveHF-X 质谱仪（Thermo）进行检测，参数设置为正离子模式，扫描范围 300～1800m/z_⨀ 。数据分析使用 MaxQuant 软件匹配 UniProt 数据库，筛选置信度 595% 的肽段用于降解位点及动力学分析。

2 结果与分析

2.1AlgU-MucAcyto 蛋白表达与纯化验证

经 IPTG 诱导后，SDS-PAGE 结果显示，在约 52kDa 处出现特异性条带，与 融合蛋白的理论分子量（AlgU32kDa+MucAcyto20kDa）一致，未诱导对照组无此条带，表明目的蛋白成功表达。Ni-NTA 亲和层析纯化后，杂蛋白条带显著减少，纯化产物在 52kDa 处呈现单一主条带，经灰度分析纯度达 90% 以上。BCA 法测定纯化蛋白浓度为 1.2mg/mL ，满足后续实验需求。Westernblot 验证显示，抗 His₆ 标签抗体在 52kDa 处检测到清晰阳性信号，进一步证实纯化产物为目标融合蛋白。动态光散射分析显示蛋白溶液粒径分布均一（多分散指数 <0.15 ），无明显聚集现象，说明纯化后的 AlgU-MucAcyto 蛋白具有良好的可溶性和稳定性，可用于后续 SspB 介导的降解反应实验。

2.2SspB 介导下的降解反应动力学初探

在 SspB 介导的降解反应体系中，通过 SDS-PAGE 动态监测显示，随孵育时间延长（ 0～120min ），AlgU-MucAcyto 原蛋白条带（52kDa）逐渐减弱，同时出现分子量约 35kDa 和 25kDa 的降解片段。灰度分析定量结果表明，反应前30min 内原蛋白剩余量快速降至初始值的 42% ， 60min 后降解速率减缓，120min时剩余量稳定在 18% 左右。对照组（无 SspB ）在相同时间内仅观察到微弱降解（剩余量 89% ），表明 SspB 显著促进降解反应。采用 ImageJ 软件对条带灰度值拟合动力学曲线，显示该降解过程符合一级反应动力学特征，计算得反应速率常数 k 为 0.021min^-1 ，半衰期约 33min 。Westernblot 验证显示，含 His₆ 标签的降解片段信号随时间增强，进一步证实其来源于原蛋白降解。上述结果表明SspB 介导的降解反应具有时间依赖性，且主要发生在反应初期阶段。

2.3 质谱检测到的主要降解片段及其分布

通过 QExactiveHF-X 质谱仪对 120min 降解反应产物检测，共鉴定出 28 个置信度 595% 的 AlgU. -MucAcyto 降解片段，分子量范围集中在 2.5＼～15kDa。其中，分子量为 3.2kDa 、5.8kDa 和 9.6kDa 的片段丰度最高，相对峰面积占比分别为18.3% 、 15.7% 和 12.5%_< 。基于肽段匹配结果，这些片段在 AlgU-MucAcyto 序列上呈现非均匀分布：AlgU 区域（1＼～290aa）检测到 17 个片段，主要集中于 N 端1～50aa 和 C 端 200～290aa 区域；MucAcyto 区域（291＼～450aa）检测到 11 个片段，以中间 100＼～200aa 区域分布为主。热图分析显示，反应 60min 后片段数量达到峰值（23 个）， 120min 时部分小片段（<5kDa）丰度下降。与 SDS-PAGE 结果对比，质谱鉴定的 9.6kDa 片段与凝胶中35kDa 条带对应区域匹配，证实质谱检测能有效捕捉主要降解产物的分布特征。

2.4 关键降解位点与氨基酸序列特征分析

对质谱鉴定的28 个降解片段进行序列比对，共定位出16 个关键降解位点，其中 AlgU 区域占 10 个，MucAcyto 区域占 6 个。位点分布显示，AlgU 的 N 端第 35 位、第 48 位和 C 端第 256 位，以及 MucAcyto 的第 352 位、第 398 位降解频率最高，对应片段丰度均超过总丰度的 10% 。氨基酸序列分析发现，这些高频降解位点的 N 端 2＼～3 位多富含亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）等疏水氨基酸，C端则常见天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）等酸性氨基酸。motif分析显示，“Leu-X-Asp”（X 为任意氨基酸）序列在 6 个主要位点周围重复出现，提示该基序可能是 SspB 介导降解的特异性识别序列，为揭示降解反应的序列依赖性机制提供了关键线索。

2.5 降解谱变化与SspB 依赖性关联性分析

通过对比有 / 无 SspB 组的降解产物谱发现，SspB 存在时降解片段总数增加 1.8 倍，且片段分子量分布更集中于 2.5＼～10kDa。定量分析显示，16 个关键降解位点中，12 个仅在 SspB 组被检测到，其中 AlgU 第 35 位、MucAcyto 第352 位等高频位点的片段丰度在 SspB 组是无 SspB 组的 4.2＼～6.7 倍。聚类分析表明，两组降解谱的皮尔逊相关系数仅为0.32，差异显著。进一步对“Leu-X-Asp”基序相关片段统计发现，含该基序的片段在 SspB 组占比达 62% ，显著高于无SspB 组的 19% 。上述结果证实，降解谱的片段组成、丰度分布及特异性位点切割均高度依赖 SspB，明确了 SspB 在介导 AlgU-MucAcyto 选择性降解中的关键调控作用。

2.6AlgU 功能结构域在降解过程中的稳定性探讨

基于 AlgU 已知功能结构域划分（σ₄ 区 200～290aa、σ₃ 区 150～199aa、σ₂ 区 80～149aa、σ₁ 区 1～79aa），对降解片段的结构域归属分析显示，σ₄ 区检 测到的片段数量最少（3 个），且在 120min 时剩余丰度达初始值的 41%，显 著高于其他结构域。σ₁ 区片段数量最多（8 个），丰度随反应时间快速下降， 120min 时仅剩 12%。质谱数据显示，σ₄ 区未出现跨结构域的降解片段，而 σ₁ 区存在多个跨区切割产物。进一步结合序列特征发现，σ₄ 区疏水氨基酸占比 达 38%，显著高于 σ₁ 区的 21%，且缺乏“Leu-X-Asp”基序。上述结果表明， AlgU 功能结构域在降解过程中稳定性存在差异，σ₄ 区因高疏水性和缺乏降解 识别基序而更稳定，为解析 AlgU 活性保留机制提供了结构层面的实验依据。

结语

本文通过质谱技术系统解析了 SspB 介导的 AlgU-MucAcyto 降解产物谱特征。验证了目标蛋白的高效表达与纯化，明确降解反应的动力学规律，鉴定出关键降解位点及“Leu-X-Asp”识别基序，证实降解谱的 SspB 依赖性，并发现AlgU 的 $＼textbf { ＼sigma } _ { 4 }$ 区具有更高稳定性。研究为阐明 SspB 调控的蛋白降解机制提供了实验支撑。

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