不同有机酸联用对大肠杆菌的抑制作用研究

大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其多出现于食品、医疗等领域的部分环节中，如果不对大肠杆菌加以抑制，难以确保民众的安全 [1]。有机酸是一种常见的化合物，因其具有抑菌作用，且易于获取，因此常用于食品、医药等领域 [2]。虽然多种有机酸均可以抑制大肠杆菌，但是单一有机酸所起到的作用较弱，基于此，本文从有机酸联用的角度进行了试验分析。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

从某实验室获取大肠杆菌，使用前将对应的培养物与甘油溶液相混合，甘油溶液的体积分数为 70% ，二者的混合比例为 1:1，混合后将其储存在 -40℃的环境中。在LB 肉汤中培养大肠杆菌。

从某生化科技公司获取乙酸、乳酸、丁酸、柠檬酸、苹果酸，上述有机酸的纯度等级均为分析纯。

从某生物公司获取罗丹明123 染料。

1.2 仪器与设备

酶标仪、荧光分光光度计、场发射扫描电镜。

1.3 方法

1.3.1 有机酸最小抑菌浓度

参考 CLSI 指南，利用微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。首先，利用生理盐水配置有机酸标准溶液（ 100mg/mL ），然后除菌。其次，配置细菌悬液。在培养大肠杆菌第一代时，培养 12 个小时，利用每分钟 4500 转的速度进行离心操作，操作时间为五分钟，然后利用生理盐水调整 OD600，直至达到 0.35，然后稀释 LB 肉汤（100 倍）。最后，测定 MIC 。在无菌 96 孔聚苯乙烯微孔板上，第一孔加入 200μL 质量浓度 10240μg/mL 经肉汤稀释的有机酸溶液，第1-8孔各加入 100μ LLB 肉汤，用移液枪作 2 倍稀释，最后一孔取 100μL 液体，随后每孔加入 100μL 细菌悬液。此时第 1-8 孔有机酸质量浓度从 5120μg/mL 依次减半至 40μμμL_⨀ 。进行三次重复性试验，空白对照组仅含与各试验组等量的生理盐水。加液后盖板微荡，37℃培养 24 小时，用酶标仪测 OD₆₀₀ ，与空白对照最接近的最小有机酸浓度即 MIC

1.3.2 测定有机酸联合抑菌指数

为测定两种有机酸的协同抑菌能力，需要用到 96 孔微孔板，同时利用棋盘格进行测定，得到联合抑菌指数（FICI）。微量棋盘法下，竖向加乙酸、横向加乳酸，调整使总体系浓度为 1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC，用 100μL 肉汤定容，各棋盘格加 100μL 细菌悬液， 37% 培养 24 小时后测 OD₆₀₀ 。FICI=（组分 A 在组合中的质量浓度 ÷ 组分 A 的 MIC） + （组分 B 在组合中的质量浓度 ÷ 组分 B 的 MIC）。FICI ⩽0.5 为协同作用； 0.52 为拮抗作用，FICI 最小的组合抑菌效果最佳。测定三种有机酸联合抑菌时，在微量棋格盘法基础上优化为三维，除横向、竖向加乙酸、乳酸，还将丁酸、柠檬酸、苹果酸作为第三种有机酸变量加入，总体浓度不变，肉汤定容等后续操作相同，依据质量浓度和 MIC 得 FICI，判断抑菌效果最优组合标准不变。

1.4 数据统计与分析

采用重复性试验法，通过测定计算得到三组平行试验的数值结果后取平均值，然后利用SPSS27.0 软件展开单因素判断，如果 P<0.05 则表示差异明显。

2 结果与分析

2.1 有机酸对大肠杆菌MIC 的影响

MIC 指的是微生物在特定时间、环境中培养后，抑制特定微生物的最低药物浓度，通过单一测定各有机酸的 MIC 可知，乙酸、乳酸、丁酸的 MIC 较低，且三者的 MIC 值一致，均为 2560μg/mL ；柠檬酸、苹果酸的 MIC 值较高，且二者的 MIC 值一致，均为 5120μg/mL 。在测定出各有机酸的 MIC 后，计算不同有机酸联用的抑菌效果。

2.2 联合抑菌作用

如图 1 所示，为不同有机酸联用的抑菌效果。其中，图 a 是两种有机酸的联用抑菌效果图，其余三图为三种有机酸的联用抑菌效果图，结合对图 1 中四图的分析，可以明确不同有机酸联合抑菌的最佳浓度以及FICI 值。经图a 分析，这种有机酸组合的 FICI 值为 0.5，根据 FICI 值可以推断出这两种有机酸在联合抑菌方面起到的是相加作用。结合另外三张图分析，这三种组合的 FICI 值均低于 0.5，所以均可以发挥出协同抑菌的效果。由此可见，联用三种有机酸的抑菌效果强于联用两种有机酸。

3 讨论

吴丽娜等学者 [3] 研究发现乳酸和过氧乙酸对大肠杆菌 O157 ∶ H7 生物膜有抑制作用，可作为食品工业杀菌剂以降低微生物污染风险。与前人研究不同，本文补充了有机酸抑菌数据，拓展了联用抑菌研究范畴，完善了相关研究体系，为食品、医药等行业控制大肠杆菌污染提供理论与实践指导，助力开发高效安全的抑菌策略。

参考文献：

[1] 陈思宇 , 孙瑞雪 , 包晨鹏 , 等 . 基于氢氧化钙为中和剂的大肠杆菌丁二酸发酵 [J]. 中国调味品 ,2024,49(10):9-13.

[2] 夏莹莹 , 董潮 , 高增兵 , 等 . 复合有机酸对大肠杆菌攻毒小鼠免疫功能及肠道菌群的影响 [J]. 江西农业大学学报 ,2022,44(5):1207-1220.

[3] 吴丽娜 , 刘昀阁 , 张一敏 , 等 . 乳酸和过氧乙酸对大肠杆菌 O157 ∶ H7生物膜的抑制作用及其机制 [J]. 食品科学 ,2022,43(9):10-18.

课题：内蒙古自治区直属高校基本科研业务费项目《大肠杆菌双向趋化行为的调控及其机制研究 》（ZSQN202304）