基于样本前处理优化的微生物检验方法敏感性提升机制研究

引言

伴随着疾病防控、食品安全、环境监测等领域需求的不断增长，对微生物检测技术的需求也越来越高。然而，传统的微生物分析如培养法耗时久、灵敏度低，在运用最前沿的分子生物学技术如 PCR、LAMP、NGS 等仍会受到样本中的杂质或靶标菌株数量过少等问题而产生误差。近来有研究表明样本前处理过程会对后续整个实验的关键过程产生重要影响，决定实验结果的正确性和试验的最终效果，因此如何找到一种适合不同样本类型、全面提高微生物检测技术敏感性的有效前处理方法成为目前急需解决的重要问题。

一、微生物检验方法敏感性的概念

对于微生物检验方法而言，敏感性是这个技术能够检测目标微生物的最低水平，通常指的是目标微生物的最小数量或最小浓度，是评价微生物测量仪器好坏的要素之一，决定着检验结果的有效性及其应用的实践价值，而面对复杂样本，预处理不当或采用不合适技术很容易判别或忽略某种重要信息，因此除了高效率的测试技术外，还得优化预处理方案，降低干扰组分的影响，提高目标元素的提取率，实现最低数量细菌的准确测定，提高病原追溯和安全管理水平。

二、基于样本前处理优化的微生物检验方法敏感性提升策略

（一）样本富集与去除干扰策略

复杂样本中的微生物往往含量非常少且含有较多的干扰物，因此，预处理的目的在于浓缩被需检测物种并将干扰物去除。如分析肉类中沙门氏菌时，在增加原样的沙门氏菌含量到能够检测水平的前提下，加入一种 24h 的选择性富集培养步骤，之后运用免疫磁珠技术对其针对性地富集，能显著地提高所富集物的纯度。这种磁力富集的过程，将非靶向细菌及食物残渣等消除了，进而能有效地降低背景的噪声。这是生物学识别技术和物理分离技术相结合，既加速了目标细菌的浓缩时间，也降低了抑制物因素对检测造成的影响，能确保后续的 PCR 或者培养实验的准确性，从而提高该方法的敏感性以及适用性。

（二）高效裂解与目标提取策略

提高微生物裂解效率及提取纯度是提高敏感性的关键。对于粪便样本中的艰难梭菌的检测，常规破碎方法常因为细胞的坚实外壳结构，不能充分释放其 DNA。因此，有研究利用融合酶法和高压破碎法，先使用溶菌酶和蛋白酶 K 破坏细胞结构，再利用 65^∘C 高压破坏细胞内的物质，然后使用硅胶膜分离出纯 DNA，从而将多糖、胆盐等 PCR 抑制物质排除。实验结果表明，该方法获得的 DNA 纯度和含量均比常规方法明显增大，而且使后续 qPCR 检测灵敏度提高 5 倍以上，便于检测微量有害菌的出现，提供了有效的技术支撑，还可通过自动化核酸提取仪的仪器达到高效率、高质量的大规模处理。

（三）多步骤协同前处理优化策略

多步骤协同优化是实现前处理全流程效能提升的重要路径。例如，在地下水中进行铜绿假单胞菌的检测，可以采取预浓缩+膜过滤+酶裂解+柱纯化的处理方式，在该方法中首先利用超滤管对待测样本进行微生物的回收，在样本中进行 0.22μm 膜过滤器的收集。细菌经过膜过滤后会用到酶解的方法对细胞壁进行破碎，使 DNA 从细胞内流出，接下来采用磁珠去除掉混合物中的杂质，这种方式将多种手段处理结合起来，使得前期处理的时间大幅度下降，处理的效率也会有明显提升。该方法处理之后，最低检测限由 102CFU/mL 下降到 10CFU/mL，提高了 27%的样本阳性识别率，由此可以对地表水的微生物污染情况进行更快速、有效的鉴定。同时还可以采用可视化的流程控制系统对流程进行有效控制，降低发生人为失误事件的可能性。

三、基于样本前处理优化的微生物检验方法敏感性提升效果

（一）检出限降低与微生物检出能力增强

对于微生物检测方法的敏感性而言，检出限是一个非常重要的评判标准。在各类食品中开展微生物前处理技术会降低检出限带来的影响，以富集培养和靶向特异性捕捉为目标会显著降低微生物检测的检出限。例如，以新型方法检测即食蔬菜中的李斯特菌的检出限仅 10CFU/g ，将原来的检出限降低了 103，比之前的微生物检测敏感性提高了 100 倍。经过多重前处理既可以在一定程度上提高目标菌浓度，还会减少其他杂菌数量以及添加的抑制剂，从而规避各种非特异性误差。在冷藏放置 24h 后仍然可以有效找到污染源，说明该种方法对于微生物变化反应迅速且准确。

（二）分析结果的准确性和重复性提升

样本前处理环节的规范化是结果准确性、精密度的关键。例如，对于鲜牛奶中金黄色葡萄球菌定量分析来说，在相同的离心沉淀-破碎-DNA 提取过程中进行相同样本的平行试验后，qPCRCt 值波动由原先的 8.5% 降至 2.3% ，数据结果更加可靠。抽取 DNA 过程中加入内部标准监控抽提过程的一致性能够有效地确定出不寻常的差异。在准确性的过程中，在模拟污染样本中加入不同的浓度的金黄色葡萄球菌，最终结果与实际浓度非常接近，相关性 R2 值也高于 0.98，证明了预处理的一致性可确保研究结果的科学性。这样结果稳定波动小的预处理方式对临床病原检测、环境监测等高要求领域具有重要意义。

（三）检验效率和适用性扩展的表现

改进样本的前处理方法能提高其敏感性，加快测试速度及扩展性，通过配备自动磁珠提取装置应对农产品进出口大批量的快速分析的测试平台，样本进行处理，提取 45 分钟完成从样本分配到破碎、浓缩和清洗，比传统方法节省一半的处理时间即 120 分钟。不仅如此，该平台是灵活平台和扩展性平台，适用于不同类型的样本，例如水样、肉类样本及蔬菜水果等，借助模块化的编程方案，只需变换起始条件就可以用于不同的微生物测试项目。应用该测试平台实现每批次增加二倍的监测量，员工介入减少 70% ，实验室的工作效率显著提升。这种标准化的试验方法能够降低因人的差错，为实现大规模、高频次的微生物安全监测提供了技术支撑。

结语：综上所述，针对样本前处理的优化是提升微生物检测方法敏感性的关键。通过优化目标菌的富集、抑制干扰物的干扰、打破细胞壁的完整性与不同的样本前处理各阶段相结合可以有效降低样本的检测下限并提高检测结果的准确性和重现性及实用性。研究表明，样本的前处理技术优化研究给复杂样本中微生物快速、准确地定量检测提供科学的分析技术支撑，以满足食品安全、环境监测及公共卫生等部门的需求。后续的工作应开展样本前处理技术规范的自动化研究，以不断提升微生物检测技术敏感性及在更多实际应用场景下的普遍应用。

参考文献：

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