HPLC法测定赖氨酸磷酸氢钙片中5-羟甲基糠醛的含量

项目名称：基于促发育儿药赖氨酸磷酸氢钙片关键技术升级的科技项目研究

摘要：文章建立赖氨酸磷酸氢钙片中5-羟甲基糠醛含量的HPLC测定方法。方法采用 HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶（4.6×250mm，5.0µm）；以2.4mmol/L的柠檬酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，线性梯度洗脱；波长为284nm；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；进样体积20μL。方法专属性好；5-羟甲基糠醛进样在0.38～74.34ng之间线性关系良好（r=1.0000）；平均加样回收率为102..8%，RSD=2.58%（n=9）；重复性RSD为 0.2%（n=6）；中间精密度RSD为0.2%（n=12）；供试品溶液36h内稳定。该方法操作简便、耐用性好、准确度好、灵敏度高，可用于赖氨酸磷酸氢钙片中5-羟甲基糠醛含量测定。

关键词：赖氨酸磷酸氢钙片；5-羟甲基糠醛；含量测定；高效液相色谱法

Abstract：A HPLC method for determination of 5-hydroxymethylfurfural in Lysine Hydrochloride and Calcium Hydrogen Phossphate Tablets was established. Methods HPLC method was used with Octadecyl and silica gel column （4.6×250mm，5.0µm）.Using a 2.4mmol/L citric acid solution as the mobile phase A， linear gradient elution was performed with methanol as mobile phase B. The wavelength is 284 nm， the flow rate was 1.0 mL per minute， the column temperature is 30 ℃， the injection volume was20μL， the method has good specificity， the linear relationship of 5-HMF injection was good between 0.38-74.34ng （r=1.0000），the average recovery was 102.8%， RSD=2.58% （n=9）， the repeatability RSD was 0.2% （n=6）， the median precision RSD was 0.2% （n=12）， the solution was stable within 36 hours. The method is simple， durable， accurate and sensitive， and can be used for the determination of 5-hydroxymethylfurfural in Lysine Hydrochloride and Calcium Hydrogen Phossphate Tablets.

Keywords： Lysine Hydrochloride and Calcium Hydrogen Phossphate Tablets; 5-hydroxymethylfurfural; determination; HPLC

引言

赖氨酸磷酸氢钙片是赖氨酸和磷酸氢钙组成的复方制剂，用于促进幼儿生长发育及儿童、孕妇补钙，为国内独家上市品种。目前仅国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-（HD-0388）-2002-2012收载此品种。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是广泛存在于含糖和药物中的小分子物质，糖在高温下经美拉德或焦糖化反应生成，可诱导I型超敏反应，具有皮肤、粘膜、呼吸道刺激性、细胞毒性和肾毒性[1-3]。因此，含有糖类的片剂药品应控制其含量。目前，未查询到赖氨酸磷酸氢钙片中5-羟甲基糠醛的测定方法。为了控制产品质量，建立了5-羟甲基糠醛的HPLC测定方法[4-5]，以便控制产品中的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器

戴安U3000型高效液相色谱仪、Chromeleon7色谱工作站；梅特勒电子天平（型号XSE205DU）。

1.1.2 试药

5-羟甲基糠醛对照品（中检院，批号：111626-202215，含量：99.5%）；赖氨酸磷酸氢钙片（修正药业集团股份有限公司，批号：240715、240716、240717）；柠檬酸（中天精细化工有限公司）；甲醇（色谱级TEDIA）；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 测定条件

色谱柱（月旭UltimateAQ-C18，4.6×250mm，5µm）；流动相A：2.4mmol/L的柠檬酸溶液，流动相B：甲醇，线性梯度洗脱（如表1所示）；检测波长为284nm；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；进样体积20μL。

1.2.2 溶液的配制

（1）供试品溶液：取赖氨酸磷酸氢钙片5片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于盐酸赖氨酸0.1g），用水溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液。

（2）5-HMF对照品储备液：精密称取5-HMF对照品适量，用水溶解并定容，摇匀，作为对照品储备液。5-HMF溶液浓度约为85µg/mL。

（3）对照品溶液：精密量取5-HMF对照品储备液适量，用水定量稀释，摇匀，作为对照品溶液。5-HMF溶液浓度约为2.0µg/mL。

（4）空白辅料溶液：按赖氨酸磷酸氢钙制备工艺配制除盐酸赖氨酸的空白辅料溶液。

（5）混合溶液：取赖氨酸磷酸氢钙片5片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于盐酸赖氨酸0.1g）置10ml量瓶中，加杂质储备液0.23ml，置于10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。

1.2.3 方法学考察

（1）专属性：分别取1.2.2中的供试品溶液、对照品溶液、空白辅料溶液，分别按1.2.1确定的条件测定考察是否有干扰。

（2）线性：分别精密量取1.2.2中（2）的对照品储备液适量，用水稀释制成6个不同浓度的对照品溶液，摇匀，作为线性考察系列梯度浓度溶液，按1.2.1确定的条件测定，记录峰面积，以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

（3）重复性试验：取6份1.2.2中的混合溶液，分别按1.2.1确定的条件测定5-羟甲基糠醛峰面积，考察6份样品测得结果RSD。

（4）中间精密度试验：由2个试验人员、在不同的时间分别取6份1.2.2中的混合溶液，按1.2.1下的条件测定5-羟甲基糠醛峰面积，考察12份样品测得结果RSD。

（5）溶液稳定性：取1.2.2中（3）的对照品溶液，室温放置，分别于0h、8h、20h、24h和36h测定5-羟甲基糠醛峰面积，考察峰面积RSD。

（6）回收率试验：按照1.2.2项下方法配制5-羟甲基糠醛储备液和供试品溶液，量取供试品溶液适量，置100mL量瓶中，分别加入适量的对照品储备溶液，用水稀释至刻度，摇匀，配制成3个浓度共9份溶液，照1.2.1确定的条件测定含量，计算方法回收率。

2 结果

2.1 专属性考察

该方法专属性良好，其他成分不会干扰目标成分测定。

2.2 线性关系考察

5-羟甲基糠醛进样量在0.38～74.34ng范围之间线性关系良好，线性方程为y=3.4146x+0.0006，相关系数r=1.0000。

2.2.1 重复性试验

测得6份相同浓度样品的RSD结果为0.4%（n=6），方法重复性良好。

2.2.2 中间精密度试验

两名实验人员不同时间测得12份相同浓度的样品的RSD为0.4%（n=12），该方法的中间精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

稳定性试验中，不同时间点测得峰面积的RSD为0.1%（n=5），表明供试品溶液在36h内稳定。

2.2.4 回收率试验

方法回收率试验考察中，理论值、测得值、回收率结果如表3所示。

2.3 样品含量测定

取赖氨酸磷酸氢钙片样品3批，分别按拟定的方法测定，以峰面积按外标法计算样品中5-羟甲基糠醛含量，结果如表4所示。

3 结语

经方法学验证和实际样品检测结果证实，本文方法可用于产品中5-羟甲基糠醛含量测定，具有操作简便、准确度高、专属性好、重复性好、稳定性强等优点，可用于产品中5-羟甲基糠醛含量测定，以控制产品质量，保证临床使用安全性。

参考文献：

[1] 林琳，林铌，凌亚豪，等.5-羟甲基糠醛的急性毒性和细胞毒性研究[J].中国药物警戒，2018，15（4）：205-209.

[2] 李恩灿，范潇予，林琳，等.5-羟甲基糠醛及其二聚体OMBF引发Ⅰ型超敏反应毒性评价与机制初探[J].中国比较医学杂志，2020，30（2）：1-8.

[3] Pastoriza DLS， Álvarez J， VéGVáRI Á， et al. Relationship between HMF intake and SMF formation in vivo： an animal and human study[J]. Molecular Nutrition & Food Research， 2017， 61（3）： 1600773.

[4] 何伍，凌霄．含葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛限度的检测方法[J].中国医药工业杂志2008，39（1）：47-49.

[5] 薛瑞琪，夏小乐．褐色发酵乳中5-羟甲基糠醛相关性分析及应用[J].食品与发酵工业，2021，47（19）：79-83.