Wnt5a在宫腔粘连大鼠中的表达及其作用探索

【摘 要】  目的： 为探索Wnt5a在宫腔粘连大大鼠子宫中的表达及探索其在IUA发病过程中作用。方法： 20只雌性SD分成2组，其中12只大鼠的双侧子宫采用刮宫加感染双重损伤法造成大鼠宫腔粘连动物模型，称模型组，其余未经特殊处理的SD大鼠为对照组。取两组子宫标本进行HE和MASSON染色对其进行纤维化半定量评分，并采用PCR技术检测Wnt5a、β-catenin、α-SMA mRNA的表达水平，采用免疫组化技术检测Wnt5a蛋白的表达水平。结果： 与对照组相比，模型组明显纤维化，且其β-catenin、α-SMA mRNA的表达均有明显的增高趋势，而Wnt5a mRNA及蛋白呈下降趋势。结论： Wnt5a的低表达可能参与大鼠子宫宫腔粘连的发生发展，且其作用与Wnt/β-catenin通路紧密相关。

【关键词】 宫腔粘连；阿谢曼综合征；大鼠；Wnt通路；Wnt5a

1 材料和方法

1.1实验动物及主要试剂

选择8-10周龄的雌性SD大鼠20只，体重约250-300g，购自南方医科大学动物中心[实验动物许可证批号：SCXK（粤）2021-0041]，普通饲料及自来水饲养，恒温22℃，通风良好。细菌脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司，多聚甲醛、兔抗Wnt5a多克隆抗体等购自武汉博士德公司，山羊抗兔抗体等购自中山金桥。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1大鼠宫腔粘连模型的制作方法 模型组在大鼠动情期采用器械加感染双重损伤法对大鼠双侧子宫造成损伤构建IUA动物模型，具体造模按照课题组前期研究方法进行[10]。造模后9天处死动物，观察子宫形态变化，保存双侧子宫组织。

1.2.2 HE染色、MASSON染色鉴定大鼠宫腔粘连模型 取大鼠子宫，经4%甲醛溶液固定24-48h后，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，行HE和MASSON染色。每张HE染色切片选取4个高倍镜视野，计数每个视野下的腺体数量，取其平均值。每张MASSON染色切片选取4个高倍镜视野，用ImagePro Plus6.0软件分析每个视野子宫内膜纤维化面积百分比（子宫内膜纤维化的面积/子宫内膜间质和腺体总面积），取平均值。结合子宫内膜纤维化的半定量评分[12]，对两组大鼠进行纤维化程度评分，评分越高纤维化程度越重。

1.2.3 PCR检测mRNA表达量 随机取8例经鉴定成功建模的小鼠的组织为模型组，8例未经任何处理的小鼠为对照组。取出并解冻标本，按照Trizol一步法提取总RNA，再经试剂盒逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，实时荧光定量检测基因的相对表达量。各基因的上下游引物序列如下。Wnt5a基因，上游引物：5’-TGTGGGCGTGGCTATGAC-3’，下游引物：5’-TGGGAGTGGGACTGGATG-3’，片段大小160bp；α-SMA基因，上游引物：5’-TGCCATGTATGTGGCTATTCA-3’，下游引物：5’-ACCAGTTGTACGTCCAGAAGC-3’，片段大小61bp ; β-catenin基因，上游引物：5’-TATTCAAACGGTTACGGC-3’，下游引物：5’-GGGAAGACACTCGCTACAT-3’，片段大小162bp ; GAPDH基因，上游引物：5’-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3’，下游引物： 5’-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3’，片段大小 77bp。逆转录为cDNA，用罗氏480定量PCR仪行标准两步法PCR反应。反应结束后观察溶解曲线、扩增曲线，以2-△△CT值表示各组目的基因相对表达水平。

1.2.4免疫组化检测Wnt5a蛋白水平变化 取大鼠子宫，经4%甲醛溶液固定24-48h后，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，常规脱蜡脱水，3% H2O2孵育15分钟，PBS洗2min×3次，抗原修复后再用PBS洗2min×3次，封闭，一抗（兔抗Wnt5a 1：150稀释）孵育，PBS洗2min×3次，二抗（山羊抗兔）孵育，PBS洗2min×3次，DAB显色，苏木素复染，脱水后进行封片。利用Image J软件检测相对光密度值并进行统计分析。

1.3 统计学方法

数据处理使用SPSS20.0统计软件在计算机上进行，所有结果用均数±标准差表示，先进行方差齐性检验，方差齐，选用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1建模及宫腔粘连模型的鉴定

通过刮宫加感染双重损伤法造模，模型组12只大鼠（24段子宫）均可见到子宫明显的缩窄环和积水，HE染色、MASSON染色结果显示模型组子宫宫腔变形且较正常大鼠宫腔面积狭小，其中有14段（67%）子宫宫腔完全闭锁。在HE染色结果显示：与对照组（5.38±1.80）相比，实验组子宫内膜腺体计数（1.42±1.12）明显降低，且差异有统计学意义（P<0.05）。MASSON染色结果显示：与对照组（0.35±0.15）相比，实验组子宫内膜胶原纤维所占比例（0.57±0.12）明显增加，且差异有统计学意义（P<0.05）。结合宫腔粘连半定量评分方法，模型组大鼠子宫纤维化程度（7.92±2.06分）明显高于对照组（0分），且有统计学差异（P<0.05）。由此可见，通过刮宫加感染的方法可建造稳定的宫腔粘连大鼠模型。具体见图1。

图1 两组大鼠子宫内膜HE染色、MASSON染色结果（×400）

A：对照组HE染色；B：对照组MASSON染色；

C：模型组HE染色；D：模型组MASSON染色。

2.2 Wnt5a、β-catenin和α-SMA 在mRNA的表达水平

模型组大鼠子宫中Wnt5a表达较对照组降低，β-catenin和α-SMA表达较对照组升高，且差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见表1。

2.3  Wnt5a蛋白表达水平

通过免疫组化技术检测Wnt5a蛋白的表达，发现Wnt5a主要分布在大鼠子宫内膜间质中；且与对照组相比，Wnt5a在模型组的表达明显降低（P<0.05）。具体见图2。

A：对照组内膜腺体；B：模型组内膜腺体；；C：对照组间质区域；D：模型组间质区域。

3 讨论

IUA是指由于宫腔手术操作和（或）感染导致子宫内膜基底层损伤，引起子宫内膜瘢痕修复，从而导致宫腔肌壁和（或）宫颈管的全部或部分闭锁[2]。目前研究表明IUA的发生发展与EMT紧密相关。发生EMT的细胞的形态及功能呈间质细胞改变。上皮细胞标志性蛋白E-钙黏蛋白、角蛋白等表达水平下降，间质细胞标志性蛋白α-SMA、波形蛋白等表达上调，此外还伴随使纤维连接蛋白、Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶的表达增加。本研究通过在大鼠动情期统一构建大鼠宫腔粘连模型，通过HE和MASSON染色对其进行纤维化半定量评分证实实验组子宫内膜腺体降低、纤维化程度明显增高，并结合PCR技术检测到实验组间质细胞标志蛋白α-SMA表达上调，验证了大鼠IUA模型的成功。

Wnt信号通路是人体中最基本的通路之一，参与了干细胞的多功能性维持或分化，以及细胞增殖。Wnt信号分子还可以激活内膜间充质干细胞并参与子宫内膜周期性再生[9]。Wnt信号转导包括经典Wnt信号通路和非经典Wnt/Ca2+、Wnt/JNK通路等，且Wnt/Ca2+通路与经典Wnt通路可相互作用[11，12]。经典Wnt信号通路即Wnt/β-catenin通路，当Wnt信号通路活化时，稳定β-catenin，使其在细胞内的积累，并进入细胞核与T细胞因子（TCF）、淋巴细胞增强因子家族的转录因子形成复合物，激活下游基因的转录[13]。经典Wnt信号通路在子宫内膜细胞增殖中起作用[9]。β-catenin是经典Wnt信号通路的核心蛋白，在增殖中晚期高雌激素作用下子宫内膜细胞的细胞核中β-catenin表达增加，而在分泌期孕激素增加而雌激素减少时细胞核中β-catenin减少[14]。目前，国内外学者发现Wnt/β-catenin通路在IUA发病机制、干细胞治疗IUA的机制中发挥重要作用：赵世云等[15]在细胞水平发现Wnt3a联合TGF-β1可激活Wnt/β-catenin信号通路，证实Wnt/β-catenin信号通路可能参与子宫内膜纤维化的形成；Liu L、王飞娜等[9，16-17]研究发现Wnt/β-catenin在IUA中被激活，通过抑制Wnt/β-catenin通路可抑制纤维化反应，从而促进IUA子宫内膜修复；Xiong Z等[9，18-19]研究发现干细胞通过介导Wnt/β-catenin信号通路促进子宫内膜细胞增殖、逆转EMT、抑制纤维化。本实验中，实验组核心蛋白β-catenin表达较对照明显增高，进一步印证Wnt/β-catenin信号通路在IUA发病机制中发挥重要作用。

参考文献

[1] Yu D， Wong Y M， Cheong Y， et al. Asherman syndrome--one century later[J]. Fertil Steril， 2008， 89（4）： 759-779.

[2] Deans R， Abbott J. Review of intrauterine adhesions[J]. J Minim Invasive Gynecol， 2010， 17（5）： 555-569.

[3]Liu L， Chen G， Chen T， Shi W， Hu H， Song K， Huang R， Cai H， He Y. si-SNHG5-FOXF2 inhibits TGF-β1-induced fibrosis in human primary endometrial stromal cells by the Wnt/β-catenin signalling pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Nov 11;11（1）：479.

[4]Chen TQ， Wei XJ， Liu HY， Zhan SH， Yang XJ. Telocyte-Derived Exosomes Provide an Important Source of Wnts That Inhibits Fibrosis and Supports Regeneration and Repair of Endometrium. Cell Transplant. 2023 Jan-Dec;32：9636897231212746.

[5] Sato A， Yamamoto H， Sakane H， et al. Wnt5a regulates distinct signalling pathways by binding to Frizzled2[J]. EMBO J， 2010， 29（1）： 41-54.

[6] van Amerongen R， Fuerer C， Mizutani M， et al. Wnt5a can both activate and repress Wnt/beta-catenin signaling during mouse embryonic development[J]. Dev Biol， 2012， 369（1）： 101-114.

[7] Okamoto M， Udagawa N， Uehara S， et al. Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/beta-catenin signaling during osteoblastogenesis[J]. Sci Rep， 2014， 4： 4493.

[8] Kumawat K， Gosens R. WNT-5A： signaling and functions in health and disease[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2016， 73（3）： 567-587.

[9]Mericskay M， Kitajewski J， Sassoon D. Wnt5a is required for proper epithelial-mesenchymal interactions in the uterus. Development. 2004 May;131（9）：2061-72. doi： 10.1242/dev.01090. Epub 2004 Apr 8. PMID： 15073149.