猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查

【摘要】猪圆环病毒PCV属于圆环病毒科圆环病毒属的一种，可造成呼吸道疾病、皮炎、肾炎、断奶仔猪综合征等情况，导致国内养猪业出现不可估量的损失。猪圆环病毒主要包含4个类型，分别为PCV1、PCV2、PCV3、PCV4。在国内猪群流行证型中PCV2、PCV3为主要亚型。现今两种证型混合感染，因住感染PCV2、PCV3两种证型后，临床保证无明显差异，辨别较难，因此针对两种类型制定专业检测方法十分重要，实施分子流行病学调查结果进一步明确了病毒的演化和致病机制。

【关键词】猪圆环病毒2型；3型；鉴别诊断方法；建立；分子流行病学

猪圆环病毒PCV是一种直径17cm左右的二十面体单链闭合环状DNA病毒。猪圆环病毒在现今以4种类型存在，主要包含猪圆环病毒1型、2型、3型、4型。PDNS病猪中可对检测到PCV2的核酸，因有些患病动物未被检测到PCV2 抗原，证实此疾病的致病性与相关因素存在直接关系。PCV3属于新发病毒，美国在2016年某猪场母猪中发现，其临床症状与PDNS十分相似，会发生多器官、心脏发炎等情况。但其与PCV1、PCV2的同源性占比为31～48%，证实PCV3的病毒与前两种类型不同[1]。自2016年之后多个国家报出此流行性病毒研究。现对其病原微生物进行进一步研究。

1.病原

1.1PCV结构和生物学特征

猪圆环病毒是一种圆环病毒科圆环病毒属，属于单股闭合环状DNA病毒，病毒离子叫做正二十面体对称，无明确囊膜结构，其大小为14～25nm，直径一般控制在17nm，在动物病毒中属于最小的病毒，病毒离子因衣壳蛋白包裹，蛋白分子量大小属于36KD。PCV相对分子质量为5.8×102KDa，且蔗糖梯度离心中沉降系数为52S，在氯化铯中浮密度一般为1.37g/cm3。PCV针对外界环境具有较强的抵抗力，在高温、酸性、低温环境下可多存活一段时间。此病毒针对发部分有机溶剂都不是特别敏感，如酒精、氯仿、碘酒、甲醛等，但其对氢氧化钠、苯酚、季胺类化合物、氧化物等相对敏感[2]。PCV的血凝活性较差，针对多种红细胞都不会发生凝集反应，不能对羊、牛、火鸡、猪以及人体红细胞进行凝集。

1.2PCV基因组织结构与编码蛋白

PCV属于共价闭合环状DNA病毒，其基因组相对较小，针对PCV2来说，基因组大小在1766～1769nt之间，其中包含11个潜在的开放性阅读框，分别是ORF1～11，且ORF1、5、7、10均处于病毒基因组链上，以上ORF依照顺时针方向实施转录，其他OEF在病毒基因组互补链上，以上依照逆时针方向实施转录，以上不同ORF间伴有基因较差、重叠情况[3]。

2.猪圆环病毒致病性研究

经大量研究显示，单独感染PCV不会出现显著临床症状，会出现轻微症状和组织损伤。猪圆环病毒可造成猪免疫系统损伤，降低免疫力，进而感染或发生其他疾病：猪伪狂犬病、猪链球菌病、猪繁殖和呼吸障碍综合征以及猪细小病毒病等疾病，其病毒与PCV联合感染可使PMWS临床症状增强，严重威胁了全球养猪业。

现今PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征、仔猪先天性震颤等多种疾病存在直接关系。PMWS是最早发现与PCV2有关的疾病，PMWS可经呼吸道、口腔等方式传播，主要发生在5～16周龄生长猪，极易在6～8周龄生长猪出现感染，仔猪发生感染的概率较小[4]。PMWS主要症状为呼吸困难、食欲不振、皮肤苍白、发热、嗜睡、背毛粗乱、黄疸、腹泻等症状。病理组织症状为淋巴组织内病毒逐渐升高，PCV组织嗜性广泛，在感染猪中可能检查到组织、器官中有病毒分布，其中腹股沟脾脏、淋巴结中病毒具有较高的含量。相关研究显示，感染猪淋巴细胞、滤泡性树突状细胞明显减少，且相关组织细胞发生大量增生情况，血液循环中极易发生淋巴细胞减少症，随之导致机体功能性紊乱，针对淋巴细胞降低因素上未明确，其与抗原递呈细胞递呈能力明显下降存在关系。

3.检测方法

PNP、PDNS、CT、PRDC等疾病与PCV2存在直接关系，其可更好地检出PCV2，PCV2成为PMES主要病原体。以上多个疾病均可检测出PCV3，其与PCV2会发生共同感染情况，其临床症状与病理变化存在直接关系，因此不能仅判断临床表征，通过实验室诊断给予确诊。

3.1聚合酶链式反应

PCR主要借助DNA半保留复制特点，体外针对这一特定核酸实施特异性扩增特定的DNA片段分子生物学技术，属于特殊DNA复制的一种方法。在实验室中经PCR技术检测病毒。

3.2实时荧光定量PCR

荧光定量PCR主要经荧光染料、荧光标记的特异性探针，标记PCR产物给予跟踪。主要采取基于STBR green的实时qPCR分析方法，对患者给予分析，荧光定量PCR的方法具有较大的灵敏度，是PCR的100倍，检测时间明显缩短，其可充分显著荧光定量PCR方法的快速、高效性，为尽早检测、诊断感染提供必要的技术和理论支持。但因其普遍性较差，价格较高，具有明显局限性。

3.3酶联免疫吸附试验

此种诊断方式可应用在血清中病毒抗体检测中，其检测原理为抗体分子、酶分子共价结合，测定显色反应，因此对免疫反应进行判断。现今对于PCV2的ELISA检测主要对于Rep、Cap蛋白，在市场上行ELISA检测方法应用较广。对于PCV3的ELISA检测主要对Cap蛋白实施诊断，市场上尚未普及。ELISA方法具有方便、快速的优点。

3.4免疫荧光试验

免疫荧光技术原理为借助荧光物质针对抗体实施标记，抗原、抗体结合后，对抗原进行定位，在荧光显微镜下对荧光反应特异性进行观察。免疫荧光技术属于新兴方法，大部分学者指出抗体分子与示踪物质相结合，对抗原进行定位。免疫荧光技术分别包含抗原、抗体两种检验方式。

3.5免疫组化

免疫组化学技术或者免疫细胞化学技术主要借助带显色剂标记的特异性抗体可对组织切片或者细胞标本中某些化学成分分布、含量、细胞原位定性、定量、定位等进行详细研究。

4.小结

猪传染病成为限制养猪业发展的重要因素，在养猪业重要猪病中猪圆环病毒病常见。PCV一共有4个类型。PCV2被称为猪圆环病毒病的主要病因，PCV3与PMWS、PDNS存在直接关系[5]。临床上猪圆环病毒感染主要表现为仔猪断后多系统衰竭综合征等。PCV2与PCV3针对国内养猪业具有较大危害性，两种病毒可导致母猪繁殖障碍，随之引发呼吸道疾病。因PCV2和PCV3临床保证十分相似，经相关研究表示，两种病毒混合感染在猪群中常见，针对两种病型诊断具有较高的挑战。在相关调查中显示，PCR使用较广，国内外有关学者依照PCV3基因设计多种PCR检测引物，构建特异、快速、灵敏的PCR检测方法。

参考文献：

[1] 王林青，樊霖，赵宇，等. 猪圆环病毒2型/3型双重荧光定量PCR检测方法[J]. 安徽农业大学学报，2021，48（4）：595-599.

[2] 朱家平，肖琦，钱雯娴，等. 猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用[J]. 江苏农业科学，2022，50（3）：172-177.

[3] 翟少伦，娄亚坤，杜丽银，等. 猪圆环病毒2型和3型双重荧光PCR检测方法建立及应用[J]. 中国动物保健，2021，23（3）：101-102.

[4] 徐朋丽，赵宇，张宇，等. 猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医学报，2019，39（1）：25-30.