平均载体拷贝数方法优化及应用

1 概述

平均载体拷贝数（Vector Copy Number，VCN）是嵌合抗元受体T 细胞（CART）产品的重要安全性指标之一，是指通过病毒载体在 T 细胞的基因组中被整合的 CAR 拷贝数平均值。中国食品药品检定研究院颁发的《CAR-T 细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》明确规定CAR 基因拷贝数 ⩽5 copies/细胞。另，在国内外法规中，对于VCN 的评价和要求日趋完善。

VCN 通常采用分子生物学手段例如qPCR 进行检测。设计CAR 目的片段的特异性引物探针，通过对细胞基因组提取，利用 qPCR 的方法，扩增目的基因片段，最终监测目的片段的拷贝数，以及内参基因的拷贝数，通过比值获得VCN 的结果，用以评价CART 的安全性。

2 平均载体拷贝数方法过程优化

2.1 方法概述

平均载体拷贝数方法，分为细胞基因组DNA 抽提，以及荧光定量 PCR 扩增两步骤。

细胞基因组DNA 抽提使用基因组抽提试剂盒，通过对细胞样本进行裂解，DNA 富集，过柱，洗脱，得到基因组DNA 样本。再通过对DNA 样本浓度测定，检测DNA 样本纯度、浓度，以识别DNA 样本的抽提质量。作为后续荧光定量PCR 扩增使用的模板。

荧光定量PCR 阶段，使用CAR 的目的片段以及内参基因设计的特异性引物、探针，以及DNA 扩增试剂盒，进行PCR 体系配制，然后加入抽提的DNA 样本作为扩增模板，经过特定程序扩增，获得CAR 目的片段的拷贝数以及内参基因的拷贝数。最终获得VCN 结果。

2.2 优化基因组DNA 抽提控制策略

（1）数据统计：汇总所有用于 VCN 检测的基因组DNA 抽提的结果，共计163 批。统计基因组DNA 的浓度，260nm 吸光值（A260）、260nm 和 280nm 的吸光值比值（A260/A280）、260nm 和 230nm 吸光值比值（A260/A230）以获得基因组DNA 纯度。

（2）数据分析

由上表可见，基因组 DNA 抽提浓度最低量为 24.157ng/μl，而 A260/A280 的浓度为 1.8～2.1 左右。对于后续CR 检测使用的模板 DNA 加入量的理论值为 100ng，即 50ng/μl 的基因组 DNA，加入 2μl。

通过对上述数据的分析，结合后续qPCR 扩增后的检验结果，对于原方法中100ng 的理论加入量，未进行实际探究，而当不满足理论加入量的样本检测结果，仍可能为合格结果。因此，后续探究该方法 qPCR 部分实际DNA 样品加入量，并通过验证证明方法的稳健性。

2.3 方法优化结论

基于上述基因组DNA 抽提结果，最低加入量的DNA 浓度为 24.157ng/μl，且后续qPCR 扩增结果良好，对VCN 的判定无影响。因此根据该统计数据，对方法进行DNA 加入量下探，以确定基因组 DNA 模板加入的最低量。同时对方法进行补充验证。

3 平均载体拷贝数方法验证

为探究及验证平均载体拷贝数基因组DNA 拷贝数最低加入量，基于上述结果，根据中国药典9101 分析方法验证指导原则，平均载体拷贝数方法属于含量测定中的定量方法，因此补充方法验证的内容检项包括线性范围、检测限、定量限及耐用性等几方面。

3.1 线性范围

（1）验证策略：该方法使用标准质粒，设计标准曲线，因此线性范围的验证浓度为标准曲线的浓度范围区间。基因 1 为 10～106 copies/μl，基因 2 的为 102～107 copies/μl，对该两项基因的区间分别进行验证，同时需满足精密度、准确度的要求。

（2）实验设计：线性范围的验证使用基因 1 和基因 2，采用连续稀释的方式，配制成6 个稀释度，即待验证稀释梯度 10～106 copies/μl 和 10²～10⁷ copies/μl，通过qPCR 扩增，计算基因1 和基因2 的标准曲线R2 值，需要满足标准曲线R2 值≥ 0.98；范围分析标准曲线各点检测结果，斜率满足-3.1～-3.8。

（3）实验操作：使用基因1 标准质粒制备 10～10⁶ copies/μl，使用基因 2 标准质粒制备 102～107 copies/μl 稀释度。按照平均载体拷贝数的qPCR 方法，进行标准曲线的qPCR 检测。进行5 次独立实验（4）实验结果：

线性：标准曲线 R2 值=1.000范围：标曲各浓度点回收率结果如下表

表6 基因1 线性范围验证结果

（5）实验结论：标准曲线的5 次独立实验线性R2 满足接受标准，斜率满足-3.1～-3.8，线性范围验证通过。3.2 检测限（1）验证策略：使用标准质粒基因1 和基因2，梯度稀释，对qPCR 的检测限进行验证，在95%的检出率应的最低浓度为该方法的检测限。

（2）实验设计：

使用基因 1 标准质粒，梯度稀释成 4 个浓度，即 1 copies/μl、5 copies/μl、10 copies/μl、20 copies/μl；使用基因 2 标准质粒，梯度稀释成 4 个梯度，即 40 copies/μl、20 copies/μl、10 copies/μl、5 copies/μl，进行 qPCR 扩增。每个浓度积累60 个孔的实验数据，检测限为至少57 个孔报阳的最低浓度。阴性的界定为仪器自身读数为未检出，或读数Ct 值 ⩾40 ，反之结果记为阳性。

（3）实验操作：

不同实验员，独立进行 3 次实验，每次使用每种基因的每个浓度，均进行20 个孔的复孔检测。（4）实验结果：检测限验证结果如下表

表7 基因1 检测限验证结果

（5）实验结论：

通过上述检测限验证结果，基因1 和基因 2 的检测限均为 5 copies/μl。

3.3 定量限

（1）验证策略：使用标准质粒基因 1 和基因2，梯度稀释，对qPCR 的检测限进行验证，满足精密度、准确度、回收率均满足的最低浓度为该方法的定量限。

（2）实验设计：

使用基因 1 标准质粒，梯度稀释成 7 个浓度，即 100 copies/μl、80 copies/μl 60 copies/μl、40 copies/μl、20copies/μl、10 copies/μl、5 copies/μl；使用基因 2 标准质粒，梯度稀释成 3 个梯度，即 100 copies/μl、50 copies/μl、25 copies/μl，进行 qPCR 扩增。独立进行3 次实验，每次实验每个浓度6 个复孔，共18 个复孔。复孔间 RSD% ⩽25% ，75%≤回收率 ⩽125% ，由高向低浓度依次判定，符合接受标准的最低浓度点为对应基因的检测限。

（3）实验操作：

不同实验员，独立进行 3 次实验，每次使用每种基因的每个浓度，均进行6 个孔的复孔检测。

（4）实验结果：定量限验证结果如下表

表7 基因1 定量限验证结果