响应型荧光探针的合成及其对细胞内锌离子的检测应用

一、引言

锌离子作为细胞内重要的微量金属离子，在酶催化、蛋白质折叠、基因转录调控等生物过程中发挥着不可替代的作用。细胞内锌离子浓度的异常变化与多种疾病的发生发展密切相关，包括神经退行性疾病、糖尿病和肿瘤等。传统的原子吸收光谱、电感耦合等离子体质谱等检测方法虽然精度较高，但无法实现活体细胞内的实时动态监测[1]。响应型荧光探针技术凭借其高灵敏度、快速响应、可视化检测等独特优势，成为细胞内锌离子检测的理想工具。

二、响应型荧光探针的设计与合成

（一）探针分子设计原理

响应型荧光探针的分子设计遵循“荧光团-连接基团-识别基团”的三元组合模式，各组分协同作用实现对锌离子的特异性识别和信号转导[1]。荧光团决定探针的基本光学性质，需要具备高量子产率、良好的光稳定性和合适的激发发射波长。识别基团通过与锌离子形成配位键实现特异性结合，常用的配位原子包括氮、氧、硫等，其空间排列和电子结构直接影响探针的选择性和亲和力。连接基团不仅起到结构桥梁作用，还通过电子效应调控荧光强度变化，实现“关闭-开启”或“开启-关闭”的响应模式。

（二）喹啉类荧光探针的合成

喹啉类荧光探针以8-羟基喹啉为基础骨架， 通过在特定位置引入 代基团实现对锌离子的选择性识别。合成路线从8-羟基喹啉出发，首先 氯化物在咪唑存在下于室温反应2小时。随后在6 位进行溴化反应， 甲烷溶剂中于0℃下反应，产率可达 85% 。接着通过Suzuki 偶联反 苯基膦）钯作为催化剂，在碳酸钾存在下于80℃反应6 小时。最后脱 呋喃中于室温反应，得到目标探针产物。

（三）荧光素类探针的合成策略

荧光素类探针具有优异的荧光性能和良好的水溶性，是细胞内离子检测的理想选择。合成策略采用间苯二酚和邻苯二甲酸酐为起始原料，在氯化锌催化下于160℃熔融反应3 小时，形成荧光素基本骨架[2]。产物经碱性水解和酸化处理后得到荧光素母体结构。为了引入锌离子结合位点，选择在荧光素的4'和5'位进行功能化修饰，通过Mannich 反应引入二乙胺基乙基侧链，反应在甲醇溶剂中于60℃下进行。进一步通过酰胺键连接引入双齿配体结构，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和1-羟基苯并三氮唑作为偶联试剂，在二甲基甲酰胺中于室温反应12 小时。该合成路线的优势在于反应条件温和、产率稳定，且产物在生理pH 条件下表现出良好的荧光稳定性。

（四）BODIPY 类探针的制备方法

BODIPY 类荧光探针因其独特的光学性质和结构可调性而备受关注，合成方法相对复杂但产物性能优异。制备过程从吡咯-2-甲醛开始，与另一分子2-甲基吡咯在三氟乙酸催化下发生缩合反应，形成双吡咯甲川结构。反应在氮气保护下于室温进行4 小时，随后加入三乙胺中和酸性条件。接着使用三氟化硼乙醚络合物进行络合反应，在二氯甲烷溶剂中于 0℃下滴加，反应30 分钟后升至室温继续反应2 小时，得到BODIPY 核心结构。为了实现对锌离子的特异性识别，在BODIPY 的3,5 位引入二（2-吡啶基甲基）胺基团，通过钯催化的 Suzuki 偶联反应实现。该方法的创新之处在于通过调控侧链基团的电子效应，实现了探针荧光强度的可调控性，同时保持了良好的水溶性和细胞透过性。

三、探针性能表征与优化

（一）光谱性质和检测性能

三类探针的光谱性质表现出显著差异，为不同应用场景提供了选择空间。喹啉类探针在紫外区显示强烈吸收，最大吸收波长位于365nm，摩尔消光系数为15,000 M⁻ ¹cm⁻ ¹[2]，在与锌离子结合后荧光强度增强12 倍，发射波长蓝移至460nm，量子产率从0.12 提升至0.45。荧光素类探针的吸收峰位于490nm，发射峰在515nm，具有良好的可见光激发特性，与锌离子配位后荧光强度增强8 倍，检测限可达50nM。BODIPY 类探针表现出最优的光学性能，吸收峰位于505nm，发射峰在525nm，具有较窄的发射带宽和高量子产率。三种探针对锌离子的检测限分别为80nM、50nM 和25nM，线性检测范围覆盖 0.1-10μM ，满足细胞内锌离子浓度检测需求。选择性实验表明，探针对锌离子的选择性系数均超过 100 倍，响应时间在 30 秒内即可达到稳态荧光信号。

（二）结构-性能关系分析

通过对比分析不同结构类型探针的性能差异，发现分子结构对检测灵敏度的影响具有明显的规律性。喹啉类探针中氮原子的配位能力是决定锌离子亲和力的关键因素，通过在喹啉环上引入给电子基团可以显著提高配位强度，从而改善检测灵敏度[3]。荧光素类探针的荧光强度变化主要源于锌离子配位引起的分子内电荷转移效应，配体结构的刚性对荧光量子产率具有重要影响。BODIPY 类探针的优异性能归因于其独特的硼络合结构，不仅提供了稳定的荧光发射，还通过侧链修饰实现了配位环境的精确调控。稳定性评估表明，BODIPY 类探针在pH4-9 范围内荧光强度变化小于 5% ，在细胞培养条件下连续监测 24 小时仍保持良好的信号稳定性。光漂白实验显示BODIPY 类探针在持续激发60 分钟后荧光强度仅下降 8% ，更适合长时间细胞成像应用。

四、细胞内锌离子检测应用

（一）细胞成像检测技术

探针的细胞摄取机制主要通过被动扩散和载体介导的转运过程实现，其中分子的脂水分配系数是影响细胞透过性的关键参数。荧光显微镜观察显示，探针在细胞内的分布主要集中在细胞质和细胞核区域，与锌离子的生理分布模式相符。使用激光共聚焦显微镜进行高分辨率成像，可以清楚观察到探针在不同细胞器中的分布差异，为研究锌离子的亚细胞定位提供了有力工具。细胞毒性评估采用MTT 法进行，结果表明在工作浓度范围内（1-10μM），三种探针对HeLa 细胞、PC12 细胞和 HepG2 细胞的存活率均保持在 95%以上，显示出良好的生物相容性。活体细胞中锌离子的实时监测实验表明，探针能够有效追踪细胞内锌离子浓度的动态变化，响应时间在细胞内环境中为 60-90 秒，满足实时监测需求。

（二）不同细胞类型的应用实例

在神经细胞系统中，锌离子的分布和浓度变化与神经传导和突触可塑性密切相关[3]。使用BODIPY 类探针对原代海马神经元进行成像检测，发现锌离子主要富集在神经元胞体和树突分支处，浓度约为800nM。当细胞受到谷氨酸刺激时，锌离子浓度在 5 分钟内快速上升至1.2μM，随后逐渐恢复至基础水平，这一过程可以通过探针的荧光强度变化实时监测。在肝细胞中的应用研究表明，锌离子主要分布在肝细胞的细胞质和线粒体中，正常生理状态下浓度维持在 600-800nM。当肝细胞暴露于氧化应激条件下时，锌离子浓度显著升高，荧光强度增强约2 倍，说明锌离子在细胞抗氧化防御机制中发挥重要作用。病理状态下的检测应用显示，在阿尔茨海默病模型细胞中，锌离子的异常聚集可以通过探针的荧光成像清楚观察到。药物干预效果的评价实验中，使用锌离子螯合剂处理细胞后，探针的荧光强度显著降低，证明了检测方法的可靠性。

参考文献：

[1]袁欣宇. 金属离子响应型荧光探针的设计与合成[D]. 华北理工大学, 2024.

[2]李洁. 几种锌离子荧光探针的设计合成及光谱响应[D]. 河南农业大学, 2021.

[3]吴琦. 新型席夫碱荧光探针对锌离子的识别检测[D]. 山西大学, 2021.