羊冷冻精液冻存工艺优化及受精能力分析

引言：

绵羊冷冻精液技术在现代畜牧业中发挥着重要作用，能够有效保存优质种质资源，提高种公羊利用效率。精子在冷冻过程中面临温度胁迫与渗透压变化等多重损伤因素，导致细胞膜破损及代谢功能下降，传统冷冻工艺在降温速率控制与保护剂配比等方面存在不足，影响冻后精子存活率及受精能力[1]。通过系统优化冷冻工艺参数，改进稀释液组成，调整降温程序，能够显著减少冷冻损伤，提高精子复苏后的生物学活性，为绵羊良种推广及遗传改良提供可靠的技术保障。

1 材料与方法

1.1 实验动物与精液采集

选择 2-4 岁健康阿旺绵羊种公羊 70 只作为实验对象，羊只体重 45⋅65kg ，经检疫无传染性疾病，性欲旺盛且精液品质良好，采用人工阴道法进行精液采集，采集前对种公羊进行为期6 个月的调教训练，通过人工饲喂草料增进人羊接触，采用发情母羊作为台羊刺激种公羊性欲。精液采集频率为每周 2 次，采集时间固定在上午 8-10 时，采集前用 75% 酒精对假阴道进行消毒处理，调节假阴道温度至 42-45^∘C ，采集后的精液立即送至实验室进行初步品质检测，剔除活力低于 70% 的不合格精液样本[2]。

1.2 冷冻精液制备工艺

精液稀释采用柠檬酸钠基础稀释液，添加 7% 甘油作为抗冻保护剂， 20% 蛋黄提供磷脂保护，青霉素及链霉素各 100IU/mL 预防细菌污染，稀释比例按 1:4 进行，稀释后的精液在 4℃条件下平衡4 小时，使精子充分适应低温环境及保护剂渗透。采用程序化降温仪进行冷冻处理，降温程序设定为 4℃至-10℃以- ⋅5^∘C/min 速率降温，-10℃至- .100^∘C 以 -40^∘C/min 速率快速降温，最后投入液氮中完成玻璃化冷冻，冷冻完成的精液细管储存于液氮罐中，储存温度维持在-196℃。

1.3 精液质量检测方法

精子活力采用计算机辅助精子分析系统测定，在 37℃恒温条件下观察精子运动状态，按照世界卫生组织标准将精子运动分为前向运动与非前向运动及不动三个等级。质膜完整性采用台盼蓝染色法检测，活精子不被染色呈无色透明状，死精子被染成蓝色，计算200 个精子中活精子所占比例，顶体完整性采用吉姆萨染色法评估，完整顶体呈深蓝色均匀着色，精子浓度使用血球计数板计数，畸形率观察精子头部与颈部及尾部形态异常情况，所有检测均在 37^∘C±0.5^∘C 范围内进行[3]。

1.4 统计学分析

实验数据采用 SPSS 25.0 统计软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验法。冷冻工艺参数优化采用正交试验设计，以精子活力及质膜完整性为主要评价指标，通过极差分析确定各因素的主次顺序及最优水平组合，受精率比较采用卡方检验，以 P<0.05 为差异具有统计学意义。建立冷冻效果评价的数学模型，通过回归分析探讨各工艺参数对精液质量的影响规律，所有试验重复 3 次以上，确保结果的可靠性及重现性[4]。

2 结果与分析

2.1 不同冷冻工艺参数对精液质量的影响

正交试验结果显示稀释液配方与降温速率及平衡时间对精液冷冻效果存在显著影响，甘油浓度在 5%-9% 范围内， 7% 甘油组精子活力最高达 51.2% ，显著高于 5% 组的38.6% 及 9% 组的 42.3% 。降温速率对比分析表明- .5^∘C/min 组冻后精子活力为 48.7% ，优于 -3^∘C/min 组的 41.2% 及- ⋅8^∘C/min 组的 39.8% ，平衡时间试验中 4 小时组精子质膜完整性达 45.8% ，明显优于2 小时组的 38.9% 及 6 小时组的 41.6% 。如表 1 所示，甘油浓度

2.2 优化冷冻工艺的精液质量评价

采用优化工艺参数制备的冷冻精液解冻后精子活力达 48.3±2.1% ，较传统工艺的35.2±3.4% 提升 37.2% ，差异极显著 (P<0.01 ），质膜完整性检测显示优化组为 42.7±1.9% ，对照组仅为 31.8±2.6% ，提升幅度达 34.3% ，顶体完整性评估中优化工艺组保持率为38.9±2.3% ，显著高于对照组的 28.4±3.1% ，精子浓度损失率优化组为 12.6±1.8% ，明显低于对照组的 23.7±2.9% 。

2.3 冷冻精液受精能力分析

人工授精试验结果表明优化工艺冷冻精液受精率为 68.4% （137/200），较传统工艺的 57.9% （115/199）提高 10.5 个百分点，差异具有统计学意义（ _(P<0.05) ，产羔率统计显示优化组为 156.2% ，对照组为 142.8% ，优化组每只母羊平均多产羔 0.13 只，冷冻精液保存 6 个月后受精率仍维持在 65.1% 水平，12 个月后为 61.7% ，显示良好的长期保存效果，受精能力的显著提升主要归因于精子活力及质膜完整性的改善。

3 讨论

精液冷冻保存过程中精子面临温度应激与渗透压变化及自由基损害等多重因素[5]。甘油作为细胞内冷冻保护剂能够降低细胞内冰晶形成风险，但浓度过高会产生渗透性毒性，浓度过低则保护效果不足， 7% 甘油浓度在保护效果与毒性之间达到最佳平衡点。降温速率对精子超微结构影响显著，过快降温导致细胞内外温度梯度过大引起质膜破裂，过慢降温使精子长时间暴露于有害温度区间， -5°C/min 的中等降温速率有利于细胞脱水与保护剂渗透的协调进行。平衡时间延长有助于保护剂充分渗入精子细胞，4 小时平衡能够实现保护效果与细胞活力的优化组合。

结语

研究通过系统的工艺参数优化，建立了绵羊精液冷冻保存的标准化技术流程，优化后的冷冻工艺在精子活力与质膜完整性等关键指标上均有显著提升，受精率达到理想水平。该技术的应用将有效推动绵羊人工授精技术发展，提高良种推广效率。未来应继续深入研究不同品种绵羊的冷冻敏感性差异，完善个性化冷冻方案，结合现代分子生物学技术探索冷冻损伤机制，进一步提升冷冻精液质量，同时加强冷冻精液长期保存效果评价，为建立完善的质量控制体系奠定基础。

参考文献

[1]王艳云,张浩,陈世琨,等.乌骨绵羊与湖羊精液冷冻复苏后精子质量及抗氧化性能差异的研究[J/OL].中国畜牧杂志,1-6[2025-06-11].

[2]李建强,杨志勇,林耀民,等.阿旺绵羊种公羊精液冷冻保存技术的研究[J].畜牧兽医杂志,2022,41(05):10-13.

[3]邓祝新,魏莎,覃孝杰,等.广西武鸣墨羊冷冻精液制作技术探讨[J].中国畜牧业,2022,(13):54.

[4]孔伟,马志远,张骞文.绵羊冷冻精液输精对受胎率的影响[J].畜牧兽医科学(电子版),2022,(12):13-15.

刘欣伟，1969.7.4，男，汉，河南省洛阳市瀍河区，副高级，本科，牛的繁殖与营养及羊的冷冻精液制作、腹腔镜输精等。