延胡索中 季铵型生物碱一测多评方法的构建

中图分类号：R284.2

延胡索为罂粟科植物延胡索 Corydalisyanhusuo W. T. Wang 的干燥块茎。延胡索生物碱中的叔胺碱和季铵碱是其主要活性成分 [1]。现代药理证明叔胺型生物碱延胡索乙素为主要的镇痛、镇静成分，季铵型生物碱脱氢紫堇碱等具有扩张冠状动脉等作用 [2]。《中国药典》2020版对延胡索药材的质量控制主要从性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别以及延胡索乙素的量进行了规定 [1]。而延胡索中除了延胡索乙素外还含有脱氢紫堇碱、巴马汀、黃连碱等多种季铵型生物碱化学成分。单指标定量测定具有一定的片面性，无法准确表达中药质量 [3]。

一测多评（QAMS）是以药材中某一成分作为内标物，依据中药有效成分间存在内在函数关系和比例关系，通过测定内标物和其他组分间的相对校正因子，根据相对校正因子计算其他组分含量的方法[6]。本研究利用延胡索中季铵型生物碱和叔胺型生物碱延胡索乙素内在的函数和比例关系，采用一测多评法，以延胡索乙素为对照，得出脱氢紫堇碱、黄连碱、巴马汀、非洲防己碱这四种季铵碱与延胡索乙素之间的相对校正因子，计算出这 4 种季铵型生物碱和延胡索乙素的量，为更确切科学地评价延胡索以及含延胡索中成药的质量提供了依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器

日本岛津高效液相色谱 LC-20AT；超声清洗机（深圳福洋科技集团有限公司）；FA1004 电子分析天平 （ 上海上平仪器有限公司 ）；GP213 电子天平（奥豪斯仪器有限公司），Waters 1525 高效液相色谱。

1.2 试药

10 批次醋延胡索收集于市场上各药店，其产地为浙江或陕西，符合《中国药典》2020 年版一部延胡索炮制品的有关规定。脱氢紫堇碱对照品（纯度 ⩾98% ，批号 CFS202301）；非洲防己碱对照品（ 纯度 ⩾98% ，批号 CFS202301） 均购于武汉天植生物技术有限公司；黄连碱对照品 （ 纯度 99.54% ，批号 MUST-24022209）；延胡索乙素对照品 （ 纯度 99.95% ，批号 MUST-24022721）；巴马汀对照品 （ 纯度99.67% ，批号MUST-23041414） 均购于成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈色谱纯；甲醇色谱纯；二水合磷酸二氢钠。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱条件

色谱柱：Venus IL MP C18 柱（ 250mm×4.6mm ， 5μm ）；流动相 A：乙腈，流动相 B： 0.03mol/L 二水合 磷酸二氢钠溶液；洗脱方式：梯度洗脱。梯度洗脱条件 0-45min 流动相 A：流动相 scriptstyleB=80：20 ；45-80min 流动相 A：流动相 B=76：24 ； 80-100min 流动相 A：流动相scriptstyleB=76：24 ；检测波长为 280nm ；流速 1mL/min ，进样量 20uL 。在本色谱条件下，延胡索中五种成分分离度良好。混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图1 非洲 防己碱；2 黄连碱；3 延胡索乙素；4 巴马汀；5 脱氢紫堇碱

2.2 供试品溶液制备

根据不同提取方法对延胡索中季铵型生物碱提取率影响供试品制备采取回流提取。取延胡索粗粉约 1g ，精密称定，置于 100mL 烧瓶中，精密加入 50mL70% 甲醇溶液，称定重量，室温浸渍 1h 后回流提取 60min ，摇匀滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至 10mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 混合对照品制备

称取延胡索乙素、黄连碱、巴马汀、脱氢紫堇碱、非洲防己碱对照品适量，加甲醇溶解。各对照品浓度分别是延胡索乙素 0.082mg/ ml；黄连碱 0.054mg/ml ；巴马汀 0.028mg/ml ；脱氢紫堇碱 0.114mg/ ml；非洲防己碱 0.054mg/ml， 。

2.4 线性范围考察

精密吸取 0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、 10.0mL 混合对照品溶液置10mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.1 项下色谱条件进样，记录色谱图。以各对照品的量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。各成分线性回归方程、相关系数（R2）见表 1。

2.5 精密度试验

取同一份混合对照品溶液，依据 2.1 项下色谱条件测定，连续进样 6 次，记录各成分峰面积。非洲防己碱、黄连碱、延胡索乙素、巴马汀、脱氢紫堇碱RSD 值分别为 1.82% 、 2.20% 、 1.87% 、 2.47% 、 1.88% 。

2.6 重复性试验

精密称取同一批延胡索药材制备供试品溶液，按色谱条件进样分析，测定 5 种待测成分的含量，并计算各待测成分含量的 RSD 值。非洲防己碱、黄连碱、延胡索乙素、巴马汀、脱氢紫堇碱 RSD 值分别为 1.65% 、 1.14% 、 2.06% 、 1.19% 、 1.97% 。

2.7 稳定性试验

精密吸取同一份混合标准溶液，按色谱条件分别于 0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，记录峰面积。非洲防己碱、黄连碱、延胡索乙素、巴马汀、脱氢紫堇碱RSD 值分别为 1.82%，2.20%，1.87%，2.47%，1.88% 。

2.8 加样回收率试验

精密称取延胡索药材 1.0g ，共 6 份，分别精密加入各对照品适量，计算各待测成分的加样回收率，非洲防己碱、黄连碱、延胡索乙素、巴马汀、脱氢紫堇碱的加样回收率分别为 102.90% ， 99.68% ，99.56% ， 93.64% 和 99.63% ，RSD 分别为 1.08% ， 0.39% ， 0.65% ， 0.32% 和 0.65% 。结果表明，本法具有良好的回收率。

2.9 相对校正因子计算

参考文献方法 [4]，采用多点校正法计算相对校正因子即以多个质量浓度点计算所得的相对校正因子取平均值作为定量用的相对校正因子，计算公式为：fs/ 。以延胡索乙素为内参物，公式中 As 为 延胡索乙素峰面积，Cs 为延胡索乙素浓度，Ai 为待测成分峰面积，Ci 为待测成分浓度。精密吸取混合对照品溶液 2、5、10、15、20、 25μL 进样，以延胡索乙素为内参物， 采用多点校正法计算其余 4 种待测成分的相对校正因子分别为 0.464、0.333、0.295、0.450，RSD 均小于 3.00% 。

2.10 待测成分色谱峰定位

对待测成分色谱峰的准确定位是实现多成分一测多评的前提，通常采用相对保留时间或保留时间差值的方法定位，而相对保留时间定位波动较小、较稳定。故而选择以相对保留时间作为待测成分定位标准。非洲防己碱、黄连碱、巴马汀、脱氢紫堇碱的相对保留时间为0.57、0.64、1.09、1.31，其相对保留时间 ±5% 范围之内。

2.11 不同色谱柱对相对校正因子的影响

考察不同色谱柱对相对校正因子的影响，分别采用 Venus IL MPC18 色 谱 柱 （250mm×4.6mm ， 5μm_⋅ ） 和 kromasil 100-5-C18 色 谱 柱（250mm×4.6mm ， 5μm） ，测得各待测成分的 fs/i 的平均值分别为非洲防己碱 0.472；黄连碱 0.341；巴马汀 0.297；脱氢紫堇碱 0.456，RSD均小于 3.00% ，表明建立的相对校正因子在不同仪器不同色谱柱上具有良好的适用性。

2.12 一测多评法与外标法比较

取 10 批延胡索药材样品适量制备供试品溶液，依上述色谱条件进样分析，记录各待测成分峰面积。采用外标法（the external standardmethod，ESM）计算各待测成分的含量，借助建立的相对校正因子计算各待测成分含量，待测成分质量浓度计算公式为： Ci=fs/i×∂[（cos ×Ai）/As] 公式中As 为内参物延胡索乙素峰面积，Cs 为内参物浓度，Ai 为待测成分峰面积，Ci 为待测成分浓度，fs/i 为待测成分与内参物相对校正因子。通过QAMS和ESM定量测定结果高度相似，结果见表6。

表6 一测多评法与外标法对 5 种生物碱成份的测定结果 （mg/g） ，

由表 6 可知，10 批醋延胡索中延胡索乙素含量 0.4949～ 1.8289 mg/gmg/g ，非洲防己碱含量在 0.3929～0.7902mg/g 之间，黄连碱含量在 0.3659～1.0854mg/g 之间，巴马汀含量在 0.2619～0.5933mg/g 之间，脱氢紫堇碱含量在 1.6941～4.4170mg/g 之间。不同厂家、不同批次、不同产地的药材中各生物碱含量存在较大的差异性。

3. 讨论

3.1 延胡索混合对照品及药材提取物采用乙腈 -0.03mol/L 二水合磷酸二氢钠溶剂体系， 0～45min ， 20% 乙腈； 45～80min ， 20% -24% 乙腈； 80～ 100min ， 24% 乙腈进行梯度洗脱，检测波长为280nm ，流速 1mL/min 时，延胡索中脱氢紫堇碱、黄连碱、巴马汀、非洲防己碱 4 个季铵生物碱和延胡索乙素可以很好分离，以此对延胡索中五种成分进行定性定量提供了较好的色谱条件，为延胡索药材质量控制提供重要依据。

3.2 本实验建立一测多评法（QAMS）用于测定醋延胡索中 5 种生物碱类成分的含量，考察了精密度、重复性、稳定性以及加样回收率，经考察精密度、重复性及稳定性的 RSD 值小于 3% ，平均回收率90%～105% 之间，均符合要求。同时考察了不同仪器不同色谱柱各成分间的相对校正因子的变化，RSD 值均小于 3% ，表明该方法具有良好的适应性。

3.3 中药具有多成分、多功效的作用特点，中药药效发挥是多种成分共同作用引起的，因此单指标定量测定具有一定的片面性，无法准确表达中药质量 [3]。中药质量控制不完善阻碍了中药产业走向国际化和现代化，建立完善的质量标准是保证中药质量和临床疗效的前提。目前中药化学成分的定量多采用外标法。外标法测定化学成分需要提供相应的对照品，并且对多种成分的测定需在多种色谱条件中进行，具有检测成本高，对照品不易获得，溶剂用量大，分析测试时间长，流动相体系复杂多样等缺点。多成分检测需要多个对照品，必将使检测成本大幅提高，这样大大地限制了多指标定量评价模式在实际生产科研领域中应用。

QAMS 可以实现用一个对照品同步测定中药中多个成分含量，解决对照品短缺问题，节省高昂检测成本，使中药的多指标质量控制和评价模式应用于生产实际成为可能。 本项目利用延胡索中季铵型生物碱和叔胺型生物碱延胡索乙素内在的函数和比例关系，采用一测多评法，以延胡索乙素为内参物，采用多点校正法计算测得脱氢紫堇碱、黄连碱、巴马汀、非洲防己碱这四种季铵碱的相对校正因子，计算出这 4 种季铵型生物碱和延胡索乙素的量，经方差分析，外标法和一测多评法计算结果并 无显著性差异（ P>0.05 ）。综上所述，一测多评法应用于延胡索的季铵型生物碱的含量测定切实可行。

参考文献

[1] 中国药典 2020 版 . 一部 [S]. 2020：145

[2] 吴雪松 ， 许浚 ， 张喜民等 . 元胡止痛方的化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中草药 ， 2015，46（7）：1081-1095.

[3] 王智民， 高慧敏， 付雪涛， 王维皓.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究 [J]. 中国中药杂志 ，2006（23）：1925-1928.

[4] 陈俊 ， 许浚 ， 张静雅等 . 基于一测多评法对延胡索中生物碱类成分的质量控制研究 [J]. 中草 药 ，2016，47（3）：493-498.

基金项目：2023 年金华市中医药科学技术研究计划项目（2023KY21）

作者简介：盛柳青（1977- ），女，人， ，副教授，研究方向为天然药物有效成分提取分离和质量控制。